Bitácora de Biología Molecular

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Objetivos

- Que el alumno extraiga ARN de células eucariotas.

- Conocer la metodología básica para la extracción de ARN total.

- Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas.

Metodología

[pic 6]

Resultado [pic 7]

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Conclusión y Discusión

Bibliografía

Práctica 3: Electroforesis

Introducción

Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del mismo, esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es más comúnmente utilizada puesto que no es tóxica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos, los grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas moléculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar mediante tinción. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN. Los más comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y recientemente el SYBER SAFE, Gel Red, Syber Green, Syber Gold, etc.

Los geles de agarosa se prepara fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta que se logre una solución transparente. La solución fundida es puesta en un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN migra hacia el ánodo. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros, algunos de los cuales son detallados a continuación.

Tamaño del ADN:

Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son inversamente proporcionales al log del número de pares de bases. Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de diferente tamaño. Pero, debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las moléculas de mayor tamaño serán retrasadas respecto a las de menor tamaño.

Conformación del ADN

El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idéntico peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la concentración de agarosa, pero también están influidas por otros factores como la corriente eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente (fundamentalmente en el caso de la forma I).

Concentración de la agarosa:

Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas para resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados.

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Corriente aplicada

A bajo voltaje, la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular disminuye. Por lo tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado.

Otros factores

Otros factores que influyen (y que no se discutirán en esta INTRODUCCIÓN) son: la dirección del campo eléctrico, la composición de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura y la composición del buffer de electroforesis.

Objetivos

- Que el alumno determine la cantidad de ADN y ARN por densitometría de las bandas en un gel de agarosa.

Metodología

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Resultados

Conclusión y Discusión

Bibliografía

Práctica 4: Extracción ADN plasmídico

Introducción

Un plásmido es una molécula de ADN extra-cromosomal, circular de doble hebra capaz de replicarse independientemente del ADN cromosomal de la bacteria huésped. La mayoría de las bacterias en la naturaleza contienen plásmidos, los cuales les dan ciertas ventajas, como la resistencia a antibióticos o la producción de enzimas de restricción. Durante los años 1970’s, muchos plásmidos artificiales fueron construidos a partir de los plásmidos existentes en la naturaleza. Estos plásmidos artificiales y sus derivados, son los vectores utilizados en los trabajos de ADN recombinante. Todos los plásmidos que son utilizados como vectores de clonación contienen 3 características: un sitio de replicación, un marcador de selección y un sitio de clonación. Por lo tanto podemos definir como vector a un plásmido en el cual se pueden insertar secuencias de ADN o genes foráneos. Los vectores generalmente son utilizados para la preservación de genes o secuencias de ADN aisladas del organismo de estudio, así como también para la expresión de proteínas recombinantes.

Durante la extracción de plásmido en el método de lisis alcalina se utilizan varias soluciones. La primera solución es una mezcla de glucosa, EDTA y RNAsa A; la glucosa hace la solución híper-osmótica lo que facilita la salida del plásmido, el EDTA se une al Ca2+ (desestabiliza las membranas) y al Mg2+ (inhibe las DNAsas) mientras que la RNAsa A degrada el ARN. La solución II contiene SDS, el cual lisa las células mientras disuelve la membrana lipídica y NaOH que desnaturaliza el ADN en hebras sencillas, pero las hebras circulares de los plásmidos permanecen juntas como anillos entrelazados. Con la solución III se precipitan los lípidos, las proteínas y el detergente; el ADN plasmídico pequeño