COMPARACION DE LA MIELINIZACION DEL CEREBRO

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Los cebadores específicos para el porcino se diseñaron usando el software Primer3 (Rozen y Skaletsky, 2000) para amplificar el ARNm específico para MBP (Adyuvante directo: 5-CCCAGGATGAAAACCC TGTA-3, Iniciador inverso: 5TCCCAGCTTGAAGATTTTGG-3. (GAPDH), actina (ACTB), proteína de activación de la tirosina 3monooxigenasa / triptófano 5-monooxigenasa, gamma (YWHAG), proteína ribosómica, P2 grande (RPLP2 ) Y 18S ribosomal rRNA (18S) se utilizaron como transcripciones de control de referencia interna.Se utilizó un método de PCR en dos etapas en tiempo real para el análisis de expresión de transcripción como se describió anteriormente (Miles et al., 2009) La expresión de MBP se determinó como (Vandesompele et al., 2002) Este software calcula una medida de estabilidad de expresión génica (M) para cada transcripción de referencia y clasifica el orden de aumento de la expresión stabi Lidad. Los transcritos de referencia más estables en el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal fueron GAPDH, ACTB y YWHAG (valores de M en cerebelo: 0,465, 0,551 y 0,482, tronco cerebral: 0,358, 0,348, 0,458, médula espinal 0,275, 0,334 , 0,370, para GAPDH, ACTB, y YWHAG, respectivamente). Al mismo tiempo, el algoritmo GeNorm calcula un NF para cada observación experimental basada en la mayor Transcripciones de referencia estables. El NF se utiliza para calcular la calidad relativa de la expresión de MBP basada en una relación de la expresión de MBP (2-Ct) a NF (Vandesompele et al., 2002).

Se usaron alícuotas (0,5 ml) de los homogeneizados tisulares para preparar mielina por centrifugación (13.000 xg). El sobrenadante se recogió, se diluyó 10 veces con Tris 10 mM, pH 8,0, y se centrifugó para recoger la mielina.

Debido a su baja densidad, la mielina se separa de las membranas plasmáticas en sacarosa 1 M (Horrocks, 1967) y luego se puede sedimentar por dilución de sacarosa. La especificidad de este procedimiento se ensayó comparando el sedimento resultante de homogenados de tronco encefálico versus homogeneizados de hígado. Los homogeneizados de tronco encefálico dieron como resultado la recuperación de un granulado mientras que los homogeneizados de hígado dieron como resultado una no recuperación (datos no mostrados).

La mielina aglomerada se sometió luego a SDS-PAGE (Buhi et al., 1989) disolviendo el sedimento en 1 ml de tampón de carga SDS-PAGE con 2-mercaptoetanol y electroforesis de 50 l de cada muestra en un gel de acrilamida al 12,5%. Los geles se tiñeron usando coomassie (Roberts et al., 1984), se formaron imágenes, y las bandas correspondientes a MBP se midieron usando densitometría (2D Advanced, Nonlinear Dynamics Inc., Durham, NC). Para densitometría, cada banda fue rodeada y la densidad media del borde de cada banda se restó como fondo. No se realizó normalización de los datos de densitometría. La identificación de las bandas como proteína básica de mielina se confirmó usando inmunotransferencia con antisuero de MBP antihumano con y sin péptido bloqueante (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), seguido de IgG anti-conejo ligado a peroxidasa de rábano como el segundo anticuerpo. Nova Red (Vector Labs, Burlingame, CA) como detector de acuerdo con las instrucciones del kit para inmunotransferencia.

Se sedimentó una segunda alícuota de 0,5 ml de homogeneizado como se ha descrito para cada muestra, el sedimento se disolvió en 2 ml de cloroformo-metanol 2: 1 y se sembraron 50 μl en placas de TLC y se dejó secar. Las placas se desarrollaron usando cloroformo: metanol: amoniaco 15 N 65: 25: 4 (Horrocks, 1968). Las placas se secaron al aire y los lípidos se tiñeron usando negro de naftol (Plekhanov, 1999). Las seis bandas de lípidos primarias resultantes se identificaron putativamente mediante la comparación del patrón de migración obtenido con el informado por Horrocks (1968), y estas identificaciones se confirmaron mediante la comparación de patrones de migración con muestras conocidas de cada lípido (colesterol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y esfingomielina , Sigma Chemical Co., St Louis, MO, qualmix glucolípido neutro (cerebrósidos), Matreya LLC, Pleasant Gap, PA). La medición de cada lípido se obtuvo por densitometría de placas de TLC manchadas con negro de naftol.

2.1. análisis estadístico

El tamaño de la camada se analizó utilizando PROC MIXED utilizando un modelo que incluía el día de gestación. El peso fetal medio y las desviaciones estándar para cada día de gestación se calcularon usando PROC MEANS. Se analizaron los pesos fetal, cerebeloso y del tronco encefálico, los resultados de MBP y mRNA y la densitometría lipídica utilizando PROC MIXED con un modelo que incluía el día de gestación, el tamaño del feto y su interacción. Se incluyó dorada en el día de la gestación como un efecto aleatorio en estos análisis y los datos se transformaron log para mejorar la homogeneidad de la varianza. Cuando era necesario, las interacciones se analizaron más a fondo utilizando un grado de libertad de contrastes ortogonales. Se realizó un análisis adicional para determinar si había cambios en la MBP o lípidos en relación con la cantidad de colesterol medida en las membranas de mielina. Para hacer esto, el anterior

Pequeño feto LS

92 97 102 107

Día de gestación

Fig. 1. Se ilustran los pesos fetales medios para todos los fetos para los días 92, 100 y 110 de gestación, junto con líneas que indican dos desviaciones estándar mayores y menores que el promedio. También se ilustran medios de mínimos cuadrados para los fetos más pequeños (círculos cerrados) y mayores (cuadrados cerrados) para los que se midió la mielinización.

El análisis se repitió para MBP y bandas de lípidos mediante el uso de mediciones de densitometría de colesterol como una covariable.

3. Resultados

El número de fetos para las cerdas jóvenes en los días 92, 100 y 110 del embarazo fue de 11,5 ± 1,4, 9,75 ± 1,4 y 11,25 ± 1,4, respectivamente, y no fueron diferentes. La Fig. 1 indica los pesos fetales medios para todos los lechones en cada día de gestación junto con líneas que indican dos desviaciones estándar mayores o menores que la media para cada día. También se representan los mínimos cuadrados para los fetos más grandes y más pequeños para cada día de gestación para este experimento, indicando que los lechones examinados en este experimento estaban dentro de dos desviaciones estándar de la media general. Los pesos fetales, cerebelosos y del tronco encefálico para