CRECIMIENTO DIAÚXICO DE Escherichia coli EN DIFERENTES FUENTES DE CARBONO

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[pic 4][d]

ANÁLISIS DE RESULTADOS[e]

En medios de cultivo con contenido de glucosa y otro carbohidrato como la lactosa, las bacterias pueden presentar dos ciclos de crecimiento completo, crecimiento diaúxico, separadas por un período de latencia. La glucosa evita la entrada de los segundos sustratos mediante un proceso conocido como la exclusión del inductor y reprime la inducción de los genes que codifican las enzimas requeridas para la utilización de los segundos sustratos[f]. [1].

En el gráfico 1 se pudo evidenciar una curva que representa un crecimiento bifásico, en el cual no se observó una fase de adaptación dando inicio a una fase exponencial hasta aproximadamente 205 minutos[g] en los medios de cultivo 1 y 2 de E. coli debido al metabolismo de la glucosa y no de la lactosa también presente en los medios de cultivo, con una absorbancia de 0,119 y 0,118, respectivamente, comportamiento esperado ya que la bacteria utiliza la glucosa de forma preferencial; mientras esta se encuentre disponible en el medio, no se expresan las enzimas implicadas en el catabolismo de fuentes alternativas de energía como la lactosa donde su operon (operon lac) no es inducido debido a que la glucosa lo reprime incluso en presencia de su inductor normal (Lactosa) [2].[h]

A partir de este tiempo 205 minutos se dio inicio a una fase de adaptación[i], observándose una disminución en la concentración de glucosa, donde posiblemente la enzima adenilato ciclasa se activó aumentando los niveles de AMPc uniéndose con CAP (proteína activadora de genes catabólicos) la cual induce la activación de la transcripción para dar inicio al metabolismo de la lactosa [j][2] evidenciada en la gráfica como una segunda fase exponencial a partir de 270 minutos, aproximadamente, donde comenzó el metabolismo de la lactosa. En E. coli, la utilización de lactosa requiere la inducción, bajo el control del operón lac, de una permeasa específica para su transporte, la enzima β-galactosidasa, hidroliza la lactosa para formar D-galactosa y D-glucosa. La D-galactosa se fosforila a galactosa-1-fosfato y se metaboliza para producir fructosa-6-fosfato, utilizandose en última instancia a través de la vía glucolítica.[k]

En E. coli, los sustratos que inducen la represión catabólica son los azúcares, principalmente la glucosa, y el control sobre los genes catabólicos para el metabolismo de otros compuestos (por ejemplo, lactosa) impiden la activación transcripcional de esos genes[l]. Las piezas claves de este sistema son el componente IIA del sistema PEP-PTS (fosfoenol piruvato fosfotransferasa) para el transporte específico de azúcares, la enzima adenilato ciclasa, el metabolito AMPc y el activador transcripcional CAP. El sistema PEP-PTS es un sistema multiprotéico que acopla la fosforilación de los azúcares con su transporte a través de la membrana y que está compuesto por tres tipos de enzimas que llevan a cabo la cadena de fosforilaciones: la enzima I (EI), la proteína HPr y la enzima II (EII), formada esta última por los dominios A, B y C. En presencia de glucosa y algunos otros azúcares en el medio. El componente citosólico (EI) se autofosforila empleando fosfoenolpiruvato (PEP) como donador y, a continuación, transfiere dicho grupo fosfato a un residuo de histidina de la proteína (también soluble) HPr, que lo dona a su vez al dominio “IIA” (específico de sustrato) que forma parte de los transportadores EII. El grupo fosfato se transfiere del dominio “A” del transportador EII al dominio “B” y, de este último, directamente al azúcar, que así fosforilado, se transporta a través del dominio “C” de la membrana [3]. [m]

En presencia de glucosa o de otros azúcares PTS, el componente EIIA se encuentra mayoritariamente desfosforilado a causa de la transferencia del grupo fosfato hasta el azúcar transportado. Sin embargo, se ha demostrado que el estado de fosforilación de EIIA no solo depende del transporte a través de PTS, sino de la relación piruvato: PEP presente en la célula. Si la cantidad de piruvato es alta con respecto a la de PEP, el componente EIIA se encontrará mayoritariamente desfosforilado, y viceversa. La represión de los operones catabólicos (operón lac) no está, por tanto, principalmente dirigida por los niveles de AMPc, ya que niveles de este metabolito similarmente bajos a los registrados en presencia de glucosa aún permiten la activación mediada por CAP. En su lugar, cobra gran importancia el mecanismo de “exclusión del inductor” mediado por EIIA desfosforilada. En ese estado, EIIA interacciona, entre otros, con el transportador LacY y lo inactiva, impidiendo la entrada de lactosa. Puesto que la lactosa funciona como inductor de su propia ruta de degradación, la interrupción de su transporte implica una represión de los genes lac. La importancia del complejo AMPc-CAP no es, sin embargo, inexistente, ya que se requiere para la expresión de los genes catabólicos y, además, contribuye a la represión catabólica a través de la activación de la expresión de los genes para los componentes EIIB y EIIC del [n]transportador de glucosa (potenciando su entrada en la célula si fuera posible [3].

En el fenómeno de represión catabólica de E. coli, es fundamental el estado de fosforilación del componente EIIA. Para la expresión de los genes catabólicos de fuentes de carbono no preferenciales (por ejemplo, la lactosa), es imprescindible que EIIA fosforilada active a la enzima adenilato ciclasa, que genera cAMP. Este metabolito se une a la proteína CAP, que solo entonces promueve la unión de la ARN polimerasa a los promotores o facilita la formación del complejo abierto, actuando, así como activador de los genes y operones catabólicos, como el operón lac para el uso de lactosa [3].

[pic 5]

FIG. 1. Esquema del sistema PEP-PTS de E.coli. Se presenta con flechas azules el sentido de actuación del sistema de actuación del sistema durante el transporte de azúcares. En presencia de altos niveles de glucosa el transporte de otros metabolitos es inhibido ( se señala a modo de ejemplo el transportador de lactosa LacY). Para la expresión de genes implicados en el metabolismo de fuentes de carbono no preferenciales resulta imprescindible la presencia del inductor de la ruta (lactosa) y la activación por CAP en presencia de AMPc (producido por la enzima adenilato ciclasa-AC-).

CONCLUSIONES[o]

- Se comprobó para E. coli, en los dos medios de cultivo, un crecimiento diaúxico, que probablemente mostró el metabolismo inicial del carbohidrato más simple (glucosa) y tras una fase de adaptación a los cambios