Curva de crecimiento de Escherichia coli: cuantificación de microorganismos

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Las gráficas 1 y 2 muestran el modo en el que variaron las dos magnitudes medidas con el pasar del tiempo:

Gráfica 1. Variación del número de células de E. coli por mililitro en el tiempo.

[pic 2]

Gráfica 2. Variación de la densidad óptica de la muestra en el tiempo.

[pic 3]

Partiendo de la gráfica 1 se observa que el crecimiento no es exponencial. La organización de los puntos puede aproximarse más a una línea recta. De acuerdo a esto, se deduce que la fase de crecimiento en la que se encontraba la colonia de E. coli al empezar las observaciones es estacionara ya que se evidencia crecimiento aún, pero de forma relativamente constante. Esto corresponde a lo reportado por en el artículo “La fase estacionaria en E. Coli” (Ramírez Santos et al., 2005), donde las colonias de esta bacteria entran en fase estacionaria a las 3 horas.

Comparando las gráficas 1 y 2 se observa que la relación entre la absorbancia y el número de bacterias es directamente proporcional. Como la absorbancia mide la concentración de algún agente orgánico en una muestra, es coherente que mientras más bacterias, mayor será la absorbancia reportada. Aún así, la última medición hay una diferencia considerable ya que la absorbancia aumenta, pero el número de bacterias reportado es menor. La causa más probable para esta discrepancia es un error en el recuento directo dado que tiene un alcance limitado: se cometen errores al no poderse distinguir fácilmente entre células vivas o muertas.

En lo que respecta al número máximo número de células, es de esperarse que pueda estimarse en la fase estacionaria dado que el crecimiento tiende a detenerse bien sea por el agotamiento de un nutriente esencial y/o el aumento de material de desecho en el cultivo. Sabiendo que el cultivo inicial se realizó partiendo de una colonia cuya absorbancia es de 0,256, en condiciones propicias la colonia debería llegar a dicho valor. Pero, la máxima absorbancia reportada fue de 0,172, por lo que el número de células por mL no alcanzó su tope. Posiblemente surgió un cambio de condiciones al inocularlo al nuevo medio, bien sea por una variación en la composición química de este (nutrientes, pH), o por cambios de temperatura.

Con respecto a las otras fases, en “La fase estacionaria en E. Coli” se establece una fase de latencia que dura aproximadamente una hora, y una exponencial de dos hojas. En este estudio no se pudo determinar la presencia y duración de la fase de latencia, ni la duración de la fase exponencial. Así mismo, como esta última no se pudo registrar, el cálculo de la tasa específica de crecimiento y del tiempo de duplicación no se efectuó ya que se hacen con base a una gráfica a escala semilogarítmica de la fase exponencial.

Cuestionario.

1 Explique en qué consisten los métodos directos e indirectos de cuantificación de microorganismos.

Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas (técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de partículas). Los métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos. La elección de un método de seguimiento del cultivo en concreto depende de las características del cultivo y del proceso.

Entre los métodos directos e indirectos se pueden destacar:

DIRECTOS

- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de fase. Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una célula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo; pero no permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas. (Tortora et al., 2007).

- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La operación de estos sistemas es sencilla y permite rápidamente determinar el número de partículas presentes en una suspensión y la distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entre células vivas y muertas ni entre células y agregados de material insoluble presente en la suspensión del cultivo. (Tortora et al., 2007).

- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. (Tortora et al., 2007).

INDIRECTOS

- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá estimar el número de células presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fácil de utilizar en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta última opción permite realizar el recuento de microorganismos microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. (Universidad de Granada, 2007).

- Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colorímetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad óptica.