Expresión en Escherichia coli de un gen sintetizado químicamente para la hormona de la somastatina

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Los radioinmunoensayos (RIA) para la somatostatina se modificaron disminuyendo el volumen de ensayo y mediante el uso de un regulador de fosfatos (Fig. 6). Esta modificación ha demostrado ser adecuado para la detección de la somatostatina en extractos de E. coli, sedimentos bacterianos de células, cultivos se trataron durante la noche en 70 por ciento de ácido fórmico que contiene bromuro de cianógeno (5 mg / ml). El ácido fórmico y el bromuro de cianógeno se eliminaron por filtración al vacío sobre KOH antes del ensayo. Los experimentos iniciales con extractos de la cepa de E. coli RRI (la cepa receptora) indicaron que menos de 10 pg de la somatostatina puede ser fácilmente detectada en presencia de 16 µg o más de proteína bacteriana tratada con bromuro de cianógeno. Más de 2 ug de proteína de los extractos bacterianos que fueron tratados con acido fórmico interfirieron de alguna manera incrementando, la escisión con bromuro de cianógeno redujo en gran medida esta interferencia. El experimento de reconstrucción mostró que la somatostatina es estable en bromuro de cianógeno.

El análisis de la secuencia de DNA de pSOM indicó que el clon que lleva este plásmido debe producir un péptido que contiene la somatostatina. Sin embargo, hasta la fecha, todos los intentos de detectar la actividad de la somatostatina por radioinmunoensayos a partir de extractos de células o sobrenadantes de cultivo no han tenido éxito. Se obtuvieron resultados negativos también cuando el cultivo en crecimiento se añadió directamente a 70 por ciento de ácido fórmico y bromuro de cianógeno. Calculamos que E. coli RRI (pSOMI) contiene menos de seis moléculas de somatostatina por célula. En un experimento de reconstrucción hemos observado que la somatostatina exógena se degrada muy rápidamente por extractos de E. coli RR1. El fracaso en encontrar actividad de la somatostatina puede ser explicada por la degradación intracelular con las enzimas proteolíticas endógenas. Si la falta de detección de la actividad de somatostatina de pSOMI fue debido a la degradación proteolítica de la proteína pequeña (Fig. 4), la unión a una proteína de gran tamaño pueden estabilizarla. El gen estructural de la β-galactosidasa tiene un sitio Eco RI cerca del extremo COOH. Los datos disponibles sobre la secuencia de aminoácidos de esta proteína sugieren que sería posible insertar el gen de la somatostatina Eco RI-Bam HI en el sitio y mantener el marco de lectura apropiado para la traducción correcta del gen de la somatostatina (Fig. 4).

La construcción de este plásmido se describe en la figura. 3. El fragmento Eco RI-Pst del plásmido pSOM1, con el elemento de control lac, se retira y se sustituye con el fragmento Eco RI-Pst de pBR322 para producir el plásmido pSOM11. El fragmento Eco RI de λplac5, que lleva la región de control del operón lac y la mayor parte del gen estructural β-galactosidasa, se insertó en el sitio Eco RI de pSOM11. Se esperaban dos orientaciones del fragmento lac Eco RI de λplac5 .Una de estas orientaciones mantendria el marco de lectura apropiado para el gen de la somatostatina, la otra no. Un número de clones independientemente aislados (con designaciones plásmido pSOM11-2 y pSOM11-3) se analizaron para su actividad de somatostatina, como se describió anteriormente. En contraste con los resultados de experimentos con pSOM1, cuatro clones (pSOM11-3, 11-5, 11-6, y 11-7) se encontró que tenían somatostatina fácilmente detectable por radioinmunoensayos (Fig. 6, a y b). El análisis de los fragmentos de restricción reveló que pSOM11-3, pSOM11-5, PSOM 1-6, y pSOM11 7 tenían la orientación deseada del operón lac, mientras que pSOM1 1-2 y 11-4 tenía la orientación opuesta. Por lo tanto, existe una correlación perfecta entre la orientación correcta del operón lac y la producción de la actividad radioinmune de somatostatina. El diseño del plásmido de la somatostatina predice que la síntesis de la somatostatina estaría bajo el control del operón lac. El gen represor lac no está incluido en el plásmido, y la cepa receptora (E. coli RR1) contiene el gen represor de tipo silvestre, que produce sólo 10 a 20 moléculas de represoras por célula. El número de copias del plásmido (y por lo tanto el número de operadores lac) es de aproximadamente 20 a 30 por célula y la represión completa es imposible. La actividad específica de la somatostatina en E. coli RR1 (pSOM11-3) se incrementó con IPTG (isopropilgalactosido), un inductor del operón lac (Tabla 1). Como era de esperar, el nivel de inducción fue bajo, variando de 2.4-a 7 veces. En el experimento 7 (Tabla 1), la -actividad, una medida de los primeros 92 aminoácidos de β-galactosidasa, también fue inducida por un factor de 2. En varios experimentos (Tabla 1 y en otros experimentos no mostrados), no hay actividad radiounmune de somatostatina antes de la escisión con bromuro de cianógeno de la proteína celular total. Dado que el antisuero utilizado en el radioinmunoensayo, S39, requiere un NH2-terminal libre de la alanina, la actividad no se esperaba antes de la escisión con bromuro de cianógeno. Después de la escisión con bromuro de cianógeno, los extractos de celulares se sometieron a cromatografía sobre Sephadex G-50 en 50 por ciento de ácido acético (Fig. 6c). En este sistema, la somatostatina está bien separada de péptidos largos y moléculas pequeñas. Sólo los extractos de clonas positivas para somatostatina mostraron actividad radioinmune en las fracciones de la columna, y esta actividad se eluye en la misma posición que la somatostatina sintetizada químicamente.

Las cepas que llevan el fragmento lac de Eco RI del operon lac (como pSOM11-2 y pSOM11-3) segregan con respecto al fenotipo de plásmido. Por ejemplo, tras el tratamiento del extracto celular 15 generaciones, la mitad de la cepa RR1 de E.coli (pSOM11-3) fue constitutiva para b-galactosidasa, es decir, contenían el operador lac y cerca de la mitad de las colonias no constitutivas fueron sensibles a ampicilina. Las cepas positivas (pSOM1 1-3) y negativas (pSOM1 1-2) para la somatostatina son inestables, y, por lo tanto, la desventaja de crecimiento proviene de la sobreproducción, grande pero incompleta e inactiva β-galactosidasa. El rendimiento de la somatostatina ha variado desde 0,001 hasta 0,03 por ciento de la proteína celular total (Tabla 1) probablemente como resultado de la selección de las células en cultivo con plásmidos con un eliminada región lac. Los rendimientos más altos de la somatostatina han sido preparados a partir de los que el crecimiento se inició a partir de una sola colonia constitutiva AmpR. Incluso en estos casos, 30 por ciento de las células en la siembra tenían deleciones de la región lac.

Varios intentos de escala moderada (hasta 10 litros) para purificar