Determinación de proteínas por el método de Bradford y su comparación con el método de Lowry

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Cálculos para determinar las diferencias de exactitud y precisión entre los métodos de Bradford y Lowry para determinación de proteínas.

Exactitud

n= 10, n-1= 9 nivel de probabilidad del 95%[pic 6]

[pic 7]

[pic 8]

[pic 9]

Por lo tanto: 7.8044 ≥ 2.262

Existe una diferencia significativa en la exactitud de los métodos

Precisión

4.03[pic 10]

Donde: Sb2 > Sa2 Sb2 = 54.17 Sa2 = 7.1049[pic 11][pic 12]

[pic 13]

Por lo tanto: 7.6243 ≥ 4.03

Existe una diferencia significativa en la precisión de los métodos

Tabla 3. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Lowry.

Tubo No.

Sustancia

A590

Cantidad de proteína (μg)

Tipo de interferencia generada

1

Tris 1M pH 7.0

0.510

54.5681818

No afecta

2

Glicerol 1%

0.558

65.4772727

No afecta

3

Detergente comercial 1%

0.576

69.5681818

Positiva

4

SDS 1%

0.348

17.75

Negativa

5

TCA 5%

0.501

52.5227273

Negativa

6

Fenol 1%

0.763

123.275

Positiva

7

Mercaptoetanol 0.1%

0.647

94.275

Positiva

8

Tris 1M pH 10.0

0.737

116.775

Positiva

9

Urea 5%

0.657

96.775

Positiva

10

Sulfato de amonio 3%

0.511

60.275

No afecta

Tabla 4. Comparación entre los métodos de determinación de proteínas de Bradford y Lowry.

Método

Bradford

Lowry

Etapas

1

2

Tiempo de reacción

10-15 min

40-50 min

Tiempo de estabilidad

1 hora

2 horas

Temperatura

Ambiente (25°C)

Ambiente (25°C)

λ

595 nm

590 nm

Color

Azul brillante

Azul intenso

Otro

Presenta un poco más de exactitud

Menos costoso

Discusión

En el análisis estadístico del método de Bradford, las absorbancias y concentraciones de proteína fueron menores a las obtenidas por los demás equipos, esto puede ser explicado ya que al leer cada tubo de la serie, se calibraba con la celda blanco, esto para disminuir el error. Además de esto, el coeficiente de variación fue mayor que en el método de Lowry, esto puede ser provocado por errores sistemáticos (pipetear el volumen por debajo del menisco, no homogeneizar la mezcla de los tubos al transferirlos a las celdas espectrofotométricas, no limpiar correctamente dichas celdas, tardar demasiado tiempo en leer las absorbancias al espectrofotómetro, ya que el compuesto colorido es estable solamente por 30 min, entre otros). Con éstos resultados, el método de Lowry es más preciso y exacto que el método de Bradford, lo que teóricamente es incorrecto, aunque esto depende del éstandar de proteína utilizado, su grado de pureza, la técnica del analista, entre otros factores. En cuánto a las interferencias, el método de Bradford es susceptible si las sustancias interferentes modifican el equilibrio del colorante (Azul de Coomassie G-250) entre las 3 especies, la que se une a las proteínas es la forma doblemente protonada bajo condiciones ácidas, modificar