EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE ZINC, SOBRE LA ERITROPOYETINA Y LA ERITROCITOSIS EXCESIVA EN RATAS EXPUESTAS A DIFERENTES REGÍMENES DE HIPOXIA

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Estas ratas se asignaran aleatoriamente en tres grupos experimentales:

1.- NX: Normóxia Normobárica; nivel del mar con un n=16

2.- CIH: Hipoxia Hipobárica Intermitente Crónica 2x2 (2 días hipoxia/2 días

Normóxia) con un n=16

3.- CH: Hipoxia Hipobárica Crónica Permanente con un n=16

A cada uno de estos grupos experimentales, se les asignará aleatoriamente dos tratamientos. La mitad de cada grupo(n=8), recibirá una dosis de suero fisiológico y la otra una dosis de sulfato de zinc. La dosis de sulfato de zinc será de 5 mg/kg/día administrados vía intraperitoneal, cada 4 días antes de cada subida a la cámara hipobárica, lo que se presenta en la tabla siguiente:

Normóxia

Hipoxia Hipobárica Intermitente Crónica

Hipoxia Crónica

Tratamiento 1: Solución Salina

n=8

n=8

n=8

Tratamiento 2: Administración de Zn

n=8

n=8

n=8

La hipoxia hipobárica se simulará en una cámara hipobárica a 428 torr, equivalente a una altitud de 4600 m sobre el nivel del mar, que mantendrá un flujo interno de 3.14 L/min del aire del ambiente (0.9 L/min de aire por rata). El grupo control será puesto en la misma habitación y a las mismas condiciones ambientales (22+2°C; 12-h de ciclo de luz y oscuridad). Los animales tendrán una alimentación disponible de 10 g/pellet por rata/día y agua (ad libitum). Los diferentes grupos serán expuestos a sus respectivas condiciones por un periodo de 30 días.

Las ratas se sacrificaran mediante anestesia (ketamina) para no provocarles dolor y la dosis será de 0.6 ml.

El protocolo, será realizado cumpliendo con las normativas para el manejo de animales de experimentación y con la aprobación del Comité de Ética de la Universidad Arturo Prat.

4.2.- Variables a Medir

4.2.1.- Generales

Los diferentes grupos serán expuestos a sus respectivas condiciones en un período de 1 mes, realizando mediciones a los 0, 15 y 30 días a cada grupo, de las siguientes variables generales: Peso (gr.), Hematocrito (%), Hemoglobina (mg/dl) Frecuencia cardiaca (latidos/min.) y Presión sanguínea sistólica (mmHg). El peso sera medido en cada bajada cada 4 días usando una balanza electrónica Acculab V-1200®, Illinois, USA, 3 horas después del descenso de la cámara hipobárica. Se les medirá Hematocrito y Hemoglobina, mediante punción cardiaca con las ratas anestesiadas, y sus resultados fueron analizados en un contador electrónico y automático hematológico (Cell Dyn 3700®, Abbott®, Santa Clara, CA, USA).

4.2.2.- Especificas

4.2.2.1.- Medición del Zinc

Los niveles de zinc, fueron determinados en plasma, en cada uno de los animales, que conformaron los grupos experimentales al inicio (día 0) y al final del protocolo (día 30). Para esta medición se utilizó la espectrofotometría de absorción atómica FAAS (213,9NM), utilizando un Varian SPECTR AA 55B®, Australia Pty. Las concentraciones plasmáticas de Zinc se midieron contra una solución estándar de Zinc (titrisol Merck® 1000 mg Zn) diluido con glicerol 5% (v/v), en un rango de 0,1 a 1.0 ug/mL de zinc en medio acido (HNO3 Suprapur). Las muestras de plasma fueron acidificadas y diluidas cinco veces en agua nanopura. Luego las medidas se realizaron en duplicado. Las mediciones fueron, efectuadas por el laboratorio del Departamento de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la UNAP.

4.2.2.2.- Expresión de mRNA de MT, HIF-2α y EPO

La muestra será obtenida desde el riñón, la cual será homogenizada para obtener los ARNm de MT, HIF-2α y EPO, de acuerdo al siguiente método de extracción: se usara fenol/isotiocianato guanidina (Chomczynski, 1987) usando TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) como se recomienda por manufactura del kit de la empresa. El DNA será digerido con desoxiribunucleasa RQ1. Finalmente, el cDNA será sintetizado usando una transcriptasa reversa de virus de leucemia murina Moloney y será almacenada a -20°C hasta ser usada en la reacción de PCR. Para la expresión de mRNA se utilizará RT-PCR y los primers específicos a utilizar se obtendrán a partir de la base de datos del GenBank.

4.2.2.3.- Medición de Hormona EPO

Se realizará a través de la técnica de ELISA donde se utilizaran muestras plasmáticas de las ratas, esta medición se realizara los días 0, 2 y 30 Se empleara microplacas con 96 pocillos de fondo plano (12 x 8). Las placas se incubarán con 100 µl del antígeno semipurificado en cada pocillo. Este antígeno será diluido en “buffer” carbonato a pH 9,6. Las placas con el antígeno serán incubadas por 3 horas a 37ºC. Luego se dejarán toda una noche a 4ºC, con agitación constante. Posteriormente serán lavadas con PBS-T20 al 0,05% tres veces, 5 minutos cada vez. Inmediatamente serán bloqueados los sitios activos, por una hora a 4ºC, con una solución de PBS-T20 0,05% más leche descremada al 3% en cámara húmeda. A continuación serán lavadas 3 veces, con PBS-T20 al 0,05%, se secarán, sellarán y se guardaran a -20ºC.

En un primer ensayo se determinara la dilución óptima del antígeno, de los sueros y del conjugado. El revelado se hará con una solución de ortofenildiamina más H202, la reacción se detendrá al adicionar 25 µl de ácido sulfúrico 2,5M por pocillo y se llevará a un lector automático de ELISA que entregará la densidad óptica.

4.2.2.4.- Medición de proteína HIF-2α

Se extraerá el riñón y se homogenizará para obtener la proteína HIF-2α la cual posee un peso molecular de 118kDa. El extractos de proteínas se prepara y analizara por Western blot. Los anticuerpos primarios a utilizar en este análisis será un anticuerpo policlonal Hif-2α. Al extracto se le agregará buffer RIPA, luego se cargaran cantidades iguales de proteína sobre un gel de poliacrilamida-SDS al 10%. Las membranas serán