ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR

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La fluorescencia es la base de la fluorimetría que abarca el conjunto de técnicas analíticas, basadas en la detección de fotones emitidos por moléculas excitadas de carácter singleto, cuando estas retornan para el estado fundamental.

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FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA

La fluorescencia es una característica por la que ciertas sustancias pueden formar de nuevo su onda de longitud de la viga que se centra en ellos, en el que se emição una clara original de la radiación coloración. Este fenómeno es particularmente desconcertante en el momento del espectro de la luz está en el intervalo ultravioleta y también en el rango visible. Dado que la emisión fluorescente es del orden de 108 s-1, el tiempo del fenómeno es del orden de 10-9 s. Una de fluorescencia caracteistica es la percepción de observación. Por lo tanto es posible asimilar un espectro de emisión de fluorescencia.

Compuestos aromáticos, alifáticos o alicíclicos que contienen carbonilo o dobles enlaces conjugados y estructuras muy rígidas, son sustancias que pueden emitir fluorescencia.

La alta sensibilidad, amplia gama de asinterferências matriz de respuesta lineal, y que la fluorescencia pocas sustancias exhibición son los más emblemantes características de fluorescencia. Un espectro de emisión de fluorescencia se relaciona estrechamente con la composición de la muestra.

Hay procesos que afectan a la intensidad de fluorescencia de las cuales se puede dividir en procesos intramoleculares y procesos intermoleculares rígidos y ricos moléculas electrones son potencialmente fluorescente. Una estructura molecular plana favorece la fluorescencia, medida que se extiende el contacto entre los electrones establecidos.

La existencia de grupos sustituyentes en la molécula es también factor importante, ya que afecta a la intensidad, en el que la presencia de grupos hidroxi (-OH), metoxi (-OR), amino (-NR 2), cianuro (CN), y sulfona (- SO3H) tienden a aumentar la fluorescencia. En contraste grupos cetona (C = O) carboxilo (-COOH) y halógeno (-X) tienden a disminuir la fluorescencia.

La viscosidad y la polaridad pueden afectar significativamente la fluorescencia. Puesto que la viscosidad puede reducir los efectos desactivantesbimoleculares por la disminución de la difusión de la desactivación de las especies y de oxígeno en el medio. La polaridad afecta directamente la energía del estado excitado. Esta reducción de potencia puede resultar en una disminución considerable en la fluorescencia.

El efecto del pH sobre conjuntos de disolventes próticos es importante principalmente en moléculas de fluorescencia. Algunas sustancias pueden inhabilitar el estado singlete excitado a través de temple dinámico. El enfriamiento rápido es la transferencia de energía por métodos no radiactivos, la sustancia en el estado excitado a otras moléculas, que se consideran desactivadores. La consecuencia más directa es proporcional a la concentración del agente desactivador y su capacidad de difusión en el medio.

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RELACIONES CUANTITATIVAS

La relación existente entre la concentración (C) y la intensidad de la radiación absorbida () es dada por la ley de Beer–Lambert: [pic 5]

[pic 6]

Donde y respectivamente ,las intensidades de radiacion incidente y transmitida, ε es La absortividad molar característica de la molecula absorvente, C es la concentración del analito y l es la espesura del camino otico recorrido por la radiación dentro del compartimiento donde se encuentra la muestra .[pic 7][pic 8]

En el proceso luminescente, Ia pasa a ser denominada de radiación de excitación.

Como varios procesos competen por la desactivación del estado excitado singleto ,la intensidad de fluorescencia If(equacion 3 ) es obtenida multiplicando la equacion 2 por of que es el factor que indica la fracción de las moléculas en el estado excitado que efectivamente fluorescen.

(3) [pic 9]

Asi, combinando las ecuaciones 2 y 3, tenemos las ecuaciones la ecuación 4:

[pic 10]

Considerando que la muestra contiene el fluoroforo (sustancia fluorescente) estuviese en solución,que exista minima perdida por esparcimiento de radiación de excitación y que los valores de sea menor que 0,02 (son condiciones ópticamente finas observadas en las soluciones diluidas de flouroforo), también se puede hacer la expansión en serie de la ecuación 4.[pic 11]

Los términos superiores de la serie pueden ser negligenciados para simplificar el procedimiento,obteniendoasi la ecuación 5:

[pic 12]

O laecuación 6:

[pic 13]

Donde el valor de k puede ser fácilmente obtenido apartir de una curva analítica.

El efecto cuantitativo de la presencia de agentes desactivadores en la fluorescencia medida es dado por la relación de Stern- Volmer (ecuación 7 ).

[pic 14]

Donde y son las intensidades de las fluorescencias en la ausencia y en la presencia del agente desactivador Q, y la constante de Stern-Volmer , que por sua vez es la razón entre la constante de velocidad de quenching ( ) y el sumatorio de las otras constantes de velocidades de los procesos de desactivación del estado excitado singleto a mencionar:[pic 15][pic 16][pic 17][pic 18]

La constante de velocidad de la fluorescencia () , la constante de velocidad del cruzamiento interno () y la constante de velocidad intersistemas (),que por sua vez es el proceso de mudanza de multiplicidad del estado excitado (-).[pic 19][pic 20][pic 21][pic 22][pic 23]

La relación entre y es dado por la ecuación 8, donde es el tiempo de vida del evento luminescente en la ausencia del agente desactivador:[pic 24][pic 25][pic 26]

[pic 27]

Considerando que la taxa para la colisionbimolecular en la solución de la temperatura ambiente es de la orden de 1010L mol-1.s-1.

En el caso de la fluorescencia , cuyo tiempo de vida es de la orden de ns ,el valor esperado para es 10Lmol-1 , que al ser sustituido en la ecuación de Stern-Volmer,