Identificación de Microorganismos con potencial para la elaboración de un biofungicida que controle la enfermedad Sigatoka Negra

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Específicos

- Identificar la Sintomatología de la Sigatoka Negra en hojas en un cultivo de plátano en tres fincas de la región de Urabá.

- Aislar y caracterizar microorganismos presentes en muestras de suelo y hojas de plátano en medio de cultivo PDA y Agar Nutritivo.

- Aislar y caracterizar Mycosphaerella fijiensis Morelet en diferentes medios de cultivo (SDX, PDA, medio de cultivo hecho con hojas de plátano).

- Determinar el efecto antagónico de hongos aislados contra Mycosphaerella fijiensis Morelet mediante enfrentamiento in vitro.

Materiales y Métodos

Identificar sintomatología del patógeno en el lugar: Para realizar el muestreo se identificó la sintomatología del patógeno basándose en una imagen encontrada por revisión bibliográfica. (Andrés Ayala, 2014)

Toma de muestras de hojas: Se llevó a cabo dos métodos de recolección y conservación, con el fin de avaluar el más eficaz para el aislamiento de Mycosphaerella Fijiensis Morelet y otros microorganismos:

1. Con el fin de conservar el material vegetal en un estado vivo y garantizar un mayor crecimiento de microorganismo en las hojas, se tomaron muestras en tres fincas plataneras ubicadas en el corregimiento de Currulao del municipio de Turbo (Antioquia). Las muestras de hojas infectadas fueron tomadas en cada finca en forma de zigzag, con una parte de la hoja sana y otra con la sintomatología del patógeno, se eligieron diez plantas por finca para tomar las hojas, y por planta dos repeticiones, las muestras fueron almacenadas en bolsas resellables con papel absorbente húmedo y conservadas en una nevera de icopor con hielo. Luego fueron llevadas al Laboratorio de Tecno-academia SENA ubicado en la I.E. Colegio Loyola Para La Ciencia y la Innovación.

2. Este segundo método se realizó con el objetivo de aislar más directamente el fitopatogeno, tomando las muestras cuando las hojas de plátano presentaban la sintomatología del patógeno en su quinta o sexta etapa de crecimiento, luego se cortaron las hojas y se llevaron al sol hasta el punto que se secaran completamente.

Toma de muestras de suelo: Para la toma de muestras de suelo se tomó en cuenta las mismas fincas pero haciéndolo con un método en el que se enumeró las diez plantas, y en cada planta que coincidía con un numero par (2,4,6,8 y 10) se tomó la muestra dando un total de 5 prototipos por finca. Las muestras se almacenaron en una nevera de icopor y se llevaron al laboratorio Tecno academia SENA ubicado en la I.E. Colegio Loyola Para La Ciencia y la Innovación y se tomaron las muestras de cada finca y se mezclaron. Luego se sacó una muestra general representativa de cada finca de 1Kg y se conservó en un lugar fresco.

Preparación del medio de cultivo: Se preparó medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) agregando 39 g de PDA en 1 L de agua des ionizada y se disolvió completamente con la ayuda de la plancha de calentamiento con agitación magnética. Se preparara medio de cultivo V8, agregando 23 g de Agar en 1200 ml de agua des ionizada, junto con 3 g de carbonato de calcio (CaCO3) y 340 ml de jugo V8 (viene ya preparado). Para preparar el medio de cultivo de hojas de plátano, como primero se agrega 15 g de Agar bacteriológico en 1 L de agua des ionizada, luego se licua 30 g de hojas de plátano junto con 10 ml de agua des ionizada, se cuela y se mezcla con el Agar bacteriológico previamente preparado. Para el agar avena, se mezcla 1000 ml de agua des ionizada con 30 g de avena y 15 g de Agar.

Luego se realizó el proceso de esterilización del medio en la autoclave con una temperatura de 121ºC durante y una presión de 15(Lb/inˆ2) por 15 minutos. Se utilizaron las cabinas de seguridad biológica para servir entre 15-20ml de medio del cultivo PDA en las cajas de Petri y se dejaron solidificar y luego se almacenaron en refrigeración (4 a 8ºC) para luego ser usadas en la siembra.

Preparación y siembra de la muestras de hoja: Debido a que se realizó dos métodos diferentes de recolección y conservación, se llevaron a cabo dos métodos de siembra:

1. Para las hojas que se conservaron en papel húmedo, se hizo un lavado de las muestras con agua de grifo y se hizo un corte de 10cm x 10cm aproximadamente, tomando una parte con la sintomatología del patógeno y otra con parte sana de la hoja; de allí se llevaron a las cabinas de seguridad biológica y con la ayuda de un bisturí se realizó otro corte de 1cm x 1cm aproximadamente a cada una de las muestras. Posteriormente se sometieron a un proceso de desinfección haciendo uso de alcohol (70%) y una concentración de hipoclorito de sodio al 1% (NaCl) y entre cada una de las concentraciones utilizadas se realizaron lavados con agua des ionizada estéril. Finalizado el proceso de desinfección de las muestras se procedió a realizar la siembra (4 muestras/caja Petri) en las cajas petri con agar PDA; y fueron incubadas a 28°C por 7 días.

2. Posteriormente con las hojas que se almacenaron secas, a estas se les realizo un corte en forma de rectángulos de aproximadamente 10cm x 5cm y se llevaron al estereoscopio para observar donde se presentaba mayor acumulación del hongo Mycosphaerella Fijiensis Morelet, donde había más acumulación del fitopatogeno, se recortaban pequeños trozos y se grapaban en un papel craft del tamaño de la tapa de la caja de petri. Luego se llevaba a la cámara de humedad durante 24h aproximadamente. Después se procedía a poner el papel con las muestras, sobre la tapa de la caja de petri con agar de tal manera que al cerrarla no lo tocara. (Andrés Ayala, 2014)

Preparación y siembra de la muestras de suelo: En el laboratorio se prepararon unas soluciones madres (1 por cada finca) de 90 mL de NaCl al 0,85% y se mezcló con 10 g de la respectiva muestra de suelo, luego, de esta solución se tomó 1 mL y se adicionó a la repetición 10-1(9 mL de NaCl), y se revolvió en el Vortex hasta su disolución, luego, de esa muestra se tomó 1 mL y se pasó a la siguiente repetición (10-2) agitándolo en el Vortex; finalmente se pasó 1 mL de la ya diluida 10-2a la 10-3 y se revolvió en el Vortex. Luego en 6 cajas de Petri (3 con medio de cultivo PDA y 3 con medio de cultivo Sabouraud, ambas con Gentamicina previamente adicionada) se agregó 500 micro litros (0,5 mL) de la repetición 10-3, de allí, se dejaron 12 horas luz/oscuridad por 7 días. Para un mejor crecimiento de bacterias, se hicieron repeticiones desde 10-1 hasta 10-5, sembrando 2 muestras de 100 micro litros (0,1 mL) de las concentraciones 10-3 y 10-5 en cajas