La verdadera depredación de los patógenos orales por Bdellovibrio bacteriovorus 109J.

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Los ensayos de biofilm

Se desarrollaron biofilms de A. actinomycetemcomitans como se ha descrito anteriormente (Izano et al., 2007, 2008) con algunas modificaciones. Aggregatibacter actinomycetemcomitans cepas rugosas de colonias se cultivaron en placas por 48 h. Las colonias se rasparon en el medio de BHI fresco y se homogeneizaron para alcanzar una concentración final de 1 · 107 CFU ml) 1 de absorbancia a 595 nm (A595) = 0,07. Las células (100 ll) se transfirieron a los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos, de fondo plano, tratadas con cultivo tisular y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C en CO2 al 10%. Las células no adherentes se eliminaron mediante lavado, y las células adherentes se tiñeron con violeta cristal al 0,1% (CV) como se ha descrito previamente (Merritt et al., 2005). Las fotografías de la placa se tomaron con una cámara Canon-scan escáner digital de 4400F. El CV (crystal violet) se solubilizó con ácido acético al 50% durante 10 min. La formación de biofilm relativo se ensayó midiendo la absorbancia de la solución de CV a 600 nm (A600). El Biofilm de la IE. corrodens se desarrolló durante 36 h en seis pocillos, tratadas con cultivo de tejidos, placas de poliestireno, que contenía cosechada células resuspendidas de Ei. corrodens en caldo TSB fresco que contiene KNO3 y hemina. Para la formación de bio fi lm en hidroxiapatita, 3 · 3 mm cuadrados de hidroxiapatita, preparados a partir de hidroxiapatita sinterizada de grado alimentario (NEI Industries, Sesser, IL;. Sreenivasan et al, 2009), se insertaron en una placa de 12 pocillos de poliestireno. Los pocillos se llenó con 0..5 ml de medio BHI que contenía células de A. actinomycetemcomitans y se incubó durante 24 horas para permitir el desarrollo de biofilm.

ensayo de rango presa

Para evaluar la capacidad de B. bacteriovorus para aprovecharse de las bacterias orales seleccionadas, se prepararon co-cultivos en las cuales las células huésped lavadas se incubaron en 20 ml de DNB con 2 ml cosechados de B. bacteriovorus. Como control, se utilizó el filtrado lisado esterilizado. Los cultivos se incubaron a 30*C en un agitador rotatorio fijado a 200 r.p.m. La capacidad de B. bacteriovorus para atacar fue confirmada por la reducción de la turbidez del cultivo causada por la lisis de las células huésped durante la depredación. La turbidez del cultivo se examinó removiendo 100 microlitros de alicuotas y leyendo la absorbancia en un lector de microplacas BioRad 680 (A595). Confirmación adicional de la depredación activa fue previsto por la evaluación microscopía (1000x aumento).

Los ensayos de eliminación de biofilm

Para evaluar la capacidad de B. bacteriovorus 109J para eliminar A. actinomycetemcomitans y Ei. Corrodens, se cultivaron como se ha descrito anteriormente, se lavaron dos veces con DNB para eliminar las células planctónicas, y 100 microlitros filtrados de B. bacteriovorus de un lisado de 18 horas fue añadido. Como control, 100 microlitros de filtrado lisado esterilizado fueron usados. Los platos se incubaron a 30*C durante la duración de los experimentos.

La remoción del biofilm de A. actinomycetemcomitans en presencia de saliva

Para investigar si la eliminación de biofilm podría tener lugar en presencia de saliva, biofilms de A. actinomycetemcomitans preformados fueron desarrollados, y lavados, y los medios de DNB fresco que contiene cantidades variables de filtro esterilizado en saliva no estimulada (de 0 a 100%), y B. bacteriovorus, fueron agregados . Se recogió saliva no estimulada, en hielo, en un tubo de 50 ml, se centrifugó durante 2 min a 5000 g para eliminar los restos celulares, y se filtró esterilizado usando 0,22-micrometros de tamaño de poro de filtro.

La depredación por B. bacteriovorus en condiciones de limitación de oxígeno

Para medir la capacidad de B. bacteriovorus de atacar en condiciones anaeróbicas y microaerofilicas, los co-cultivos hospederos de B. bacteriovorus se prepararon y se colocaron en un BD GasPak Jar Systems con un generador de gas anaeróbico desechable o un sobre microaerofılico (BD Diagnostic Systems, Franklin Lakes, NJ.). Los frascos se incubaron a 30*C en un agitador rotatorio a 200 r.p.m. La depredación se midió utilizando CFU de las células huésped supervivientes.

La obtención de las biopelículas metabólicamente inactivos

Para obtener biofilm metabólicamente inactivos de A. actinomycetemcomitans, los biofilms de A. actinomycetemcomitans CU1000 se desarrollaron como se ha descrito anteriormente, lavados e incubados durante 96 h en DNB. Para confirmar pérdida de viabilidad del biofilm, se eliminaron las células del biofilm con la ayuda de un raspador de cultivo de tejidos, y se sembraron en placas BHI para enumeración de CFU. Verificacion adicional de la perdida de actividad del metabolismo de la célula se midió mediante la adición de reactivo de la viabilidad celular Alamar-Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA) a la biofilm y midiendo el cambio en la fluorescencia (Pettit et al., 2005). AlamarBlue trabaja como un indicador de la viabilidad celular y la proliferación a través de la conversión de la resazurina a resorufina. La resazurina, un colorante indicador no fluorescente, se convierte en una resofurina altamente fluorescente de color rojo a través de reacciones de reducción de células metabólicamente activas. La cantidad de fluorescencia producido es proporcional al número de células vivas (ficha técnica del producto; Trek Diagnostic Systems, Cleveland, OH). Ni señal de fluorescencia o crecimiento de colonias fueron medidos en el biofilm de 4 dias suspendido con DNB, confirmando la perdida de la viabilidad celular del biofilm.

Microscopio de escaneo de electrones

Los experimentos se realizaron como se describe anteriormente (Kadouri & O'Toole, 2005). En resumen, los biofilms son desarrollado en una hoja de cubierta de plástico de PVC de 12 mm · 12 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Los cubreobjetos se colocaron en una placa de cultivo celular de poliestireno de 24 pocillos (Corning Inc., Corning, NY). Los biofilms preformados y los ensayos de la depredación se prepararon como se ha descrito anteriormente. Los experimentos se llevaron a cabo en un volumen 1,0 ml. Los biofilms se aclararon para eliminar cualquier célula planctónicos antes de ser fijado en 2% de glutaraldehído, 0,1 M cacodilato de sodio, y 0,1% de rojo de rutenio. Las imágenes fueron vistas en la interfase aire-líquido utilizando un Zeiss Auriga