Los grandes Métodos de detección de agentes patógenos adquiridos a través de los alimentos basados en el uso de ácidos nucleicos

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- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): método molecular más usado comúnmente. La PCR multiplica exponencialmente una secuencia específica de ADN de doble cadena sintetizando grandes cantidades de un segmento específico de ADN a partir de cantidades inferiores del ADN de la muestra. Comprende varios ciclos divididos en tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión del cebador. Estos tres pasos constituyen un ciclo, el cual se repite cierto número de veces para obtener millones de copias del fragmento de interés. La reacción se lleva a cabo gracias a la presencia de desoxirribonucleótidos trifosfatos, oligonucleótidos específicos, la enzima polimerasa y una solución tampón (Rodríguez-Lázaro y Hernández, 2015).

- PCR múltiplex: técnica que sigue los mismos fundamentos que la PCR convencional pero que permite la detección simultánea de más de una secuencias de nucleótidos en una sola reacción mediante el empleo de dos o más parejas de oligonucleótidos o cebadores. En este caso, los cebadores deberán reaccionar a una temperatura de fusión similar. Los tamaños de los productos amplificados de la PCR deberán también ser semejantes pero distinguibles, entre valores de 200 a 500 pares de bases (Zhao et al., 2014).

- PCR en tiempo real: la metodología es muy similar a la PCR convencional, pero con la ventaja de poder monitorear el progreso de la reacción a medida que ésta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso y no al final de la reacción. En esta técnica se utilizan moléculas de un reportero fluorescente que sirve para monitorear la amplificación de los productos durante cada ciclo de reacción, siendo proporcional la intensidad de la fluorescencia a la cantidad de productos amplificados. Se trata de una combinación de los pasos de amplificación de ADN con la detección en un único ensayo evitando así tener que preparar geles de electroforesis para detectar los productos amplificados. También es posible utilizar varios cebadores diferentes en la misma reacción al igual que en la PCR Múltiplex. De igual manera si se utiliza ARN como molécula blanco estaríamos hablando de una retrotranscripción de PCR en tiempo real (Law et al, 2015).

- Chips microfluídicos: el término mucrofluídico se refiere a la tecnología necesaria para mover cantidades muy pequeñas de líquido (nanolitros y picolitros) a través de canales microscópicos en un dispositivo. Primero el ADN es extraído y purificado para su amplificación mediante PCR o NASBA, los productos pueden ser visualizados mediante fluorescencia. Cabe señalar que todos los pasos ocurren dentro del chip, por lo que se puede usar en muestras directamente (Zhao et al., 2014).

- Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA): es una tecnología independiente de oligonucleótidos que amplifica secuencias de nucleótidos en una reacción sencilla bajo condiciones isotérmicas de temperatura. Esta característica permite el uso de dos o tres enzimas de forma simultánea: transcriptasa inversa, RNasa H y una ARN polimerasa dependiente de ADN; de esta forma se imita el ciclo de vida retroviral, produciendo ARN a partir de ADN (Fratamico y Bayles, 2005).

- Microarreglos de ADN: consiste en múltiples fragmentos pequeños de ADN complementario (cada uno de los cuales representa un gen diferente) adheridos a un soporte físico. Cada fragmento están diseñados para hibridar con una parte específica de una secuencia de adn. La muestra con fragmentos de nucléotidos (ADN, ARNm o ADNc) son etiquetados mediante un marcador fluorescente y desnaturalizados para generar cadenas sencillas. Dichos fragmentos hibridarán en el soporte junto con su fragmento complementario y la seña será visualizada mediante la señal fluorescente producto de la hibridación (Wang y Salazar, 2015).

- Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos mediada por LOOP (LAMP): el método LAMP está basado en el principio de síntesis de ADN por desplazamiento de cadena, el cual es llevado a cabo por una polimerasa con alta actividad de desplazamiento (ADN polimerasa Bst) de cadena y un sistema de dos cebadores internos y dos cebadores externos para reconocer un total de seis secuencias distintas en el ADN blanco. Estructuras de ADN con múltiples bucles (loops) de diferentes tamaños son los productos de esta reacción (Sánchez et al., 2014).

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Ventajas y desventajas

Técnica

ventajas

desventajas

Agente patógeno comúnmente usado

Molécula diana

Visualización de productos

Basadas en PCR

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se pueden detectar toxinas amplificando genes que codifican para las toxinas bacterianas

Puede ser alterada por la presencia de agentes inhibidores en la muestra.

No distingue entre células vivas o muertas.

Salmonella enterica, Enteritidis, Listeria monocytogens,

ADN

Electroforesis en gel

PCR múltiplex

Puede utilizar varios sets de oligonucleótidos, reduciendo tiempo y esfuerzo.

Puede detectar más de cinco bacterias patógenas en un solo ensayo.

Los cebadores deben ser diseñados cuidadosamente con temperaturas de fusión similares.

La concentración de cada cebador también debe ser validada debido a la interacción que puede ocurrir entre ellos.

Se necesita realizar una correcta optimización de las concentraciones de todos los reactivos que participan en la reacción.

No distingue entre células vivas o muertas.

Salmonella spp.,

Enteritidis,

Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica.

ADN

Electroforesis en gel

PCR