PCR en el diagnóstico de la infección : Detección de Las bacterias en fluidos cefalorraquídeo

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de falsos positivos ha sido identificado como el arrastre de producto amplificado a partir de reacciones anteriores. La contaminación por arrastre de reactivos, pipetas, superficies de laboratorio, o incluso la piel de los trabajadores pueden dar resultados falsos positivos. Para controlar tales contaminación por arrastre, se debe evitar la transferencia física de ADN entre muestras amplificadas, y entre los controles experimentales positivos y negativos. Para este propósito, la preparación de muestras para el ensayo de PCR debe estar en una habitación o de bioseguridad capucha separada de aquella en que se llevan a cabo las reacciones. Utilizando una punta de pipeta con una barrera de aerosol es esencial para evitar la contaminación cruzada, así como la contaminación por arrastre. la exposición UV también es capaz de destruir amplicones contaminantes pero es eficiente sólo en las superficies y con amplicones de más de 300 pb de tamaño.. El uso de uracilo N-glicosilasa (UNG) para escindir el dUTP incorporado en productos de la PCR se considera un potente protocolo para prevenir la contaminación por arrastre amplicón enzimáticamente, particularmente en un laboratorio clínico que está realizando PCR extensamente. Esto se realiza mediante la sustitución de dUTP por dTTP y la adición de UNG a la mezcla principal. Para proteger el producto que contiene dUTP-, UNG debe ser inactivado químicamente o por calor antes de que el producto de la PCR puede ser analizado más. Por lo tanto, el protocolo de dUTP requiere sólo dos cambios en un protocolo de PCR estándar: la sustitución de dUTP por dTTP en todas las reacciones y la incubación de todas las mezclas de PCR con UNG antes de los ciclos de temperatura. De hecho, este protocolo se ha aplicado con éxito a la detección de Toxoplasma gondii en el LCR, así como otras muestras clínicas..

Extracción de ADN. Desde muestras clínicas tienen los inhibidores de PCR, tales como hemina, que se une a la polimerasa Taq y bidores su su actividad, de purificación de ADN es importante para evitar tales efectos. De hecho, los inhibidores se detectan con frecuencia en imens CSF específicos y de ebullición del CSF no es suficiente para la eliminación de inhibidores que afectan a la detección de microbios por PCR. El rendimiento de la extracción de ADN diana es también un factor crítico en la detección por PCR de bacterias en muestras clínicas, particularmente cuando se espera que sólo unas pocas bacterias para estar en especímenes. Puesto que las bacterias tienen una pared celular rígida, que puede resistir a un protocolo de digestión ordinaria para la extracción de ADN, el protocolo de extracción de ADN bacteriano en muestras clínicas debe ser una consideración adicional para la preparación de la muestra.

El protocolo de extracción de ADN clásico se basa en la purificación con disolventes orgánicos como fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol. Los precipitados obtenidos a partir de LCR que contiene sólo unas pocas bacterias pueden contener demasiado poco material y pueden no ser visibles. Por lo tanto, el manejo de estos precipitados puede requerir conjeturas, sobre todo durante el lavado de los precipitados. Por lo tanto, parece probable que el rendimiento resultante de ADN bacteriano de CSF con sólo unas pocas bacterias puede no ser coherente. En este sentido, un estudio reciente ha desarrollado un nuevo protocolo para la purificación de ADN mediante el uso de los portadores en fase sólida, que absorben selectivamente ácidos nucleicos.

Este protocolo se basa en la naturaleza de los ácidos nucleicos, que pueden unirse a partículas de sílice o de vidrio en presencia de agentes caotrópicos tales como: NaI o NaClO 4. Una extracción de arena de purificación de ADN filtro de fibra de caotrópico (GFX ;. Pharmacia Biotech, Milwaukee, Wisconsin) es un protocolo Tal y utiliza una matriz de fibra de vidrio para aislamiento de ADN. Un kit de aislamiento de ADN basada en el método de guanidinio isotiocianato de talón-sílice es comercialmente disponible (kit Nuclisens aislamiento, Organon Teknika, Durham, Carolina del Norte) Presente. Los resultados de ADN de aislamiento Nuclisens kit de rendimiento suficiente y altamente reproducible para globina PCR en células fijadas. Sin embargo, no hay ningún informe respecta a la aplicación de tales kits para el aislamiento de ADN bacteriano de muestras clínicas. Fahle y Fischer examinarse la eficacia del aislamiento del ADN viral a partir de especímenes clínicos, incluyendo CSF, utilizando seis kits de tracción de ADN comercial ex diferentes. Fue en el informe concluye que el kit Nuclisens aislamiento y el kit de aislamiento de ADN Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, Minn.) Los más sensibles fueron algunos de los kits de la prueba, así como los opcionales Generación columna de captura (Gentra Systems), MasterPure kit de purificación de ADN (epicen- entre Technologies, Madison, Wis.), ex tracción IsoQuick kit de ácido nucleico (MicroProbe Corp., Bothell, Wash.), y el kit de la sangre QIAamp (Qiagen, Valencia, Ternero.), para la extracción de citomegalovirus virus de ADN de muestras clínicas, a partir de la recuperación de ADN con la amplia gama de tipos de muestras evaluadas. evaluaciones similares de las extracciones de ADN con los kits comerciales se realizaron también por otros tres grupos. De estos estudios, se encontró el kit QIAamp a ser más adecuados que otros métodos comerciales y no comerciales evaluados para la extracción de ADN para PCR. Algunos kits de extracción y purificación disponibles en el comercio sobre la base de una purificación en fase sólida se enumeran en el protocolo de la Tabla 1. Estos kits no sólo eliminan conjeturas sino también ex- fenol-cloroformo pasos de tracción de trabajo intensivo. Sin embargo, sólo hay información limitada miento sobre el aislamiento del ADN bacteriano de muestras clínicas, CSF, particularmente con kits comerciales en el original.

Los genes diana. La elección de los genes diana y el diseño de cebadores de oligonucleótidos son elementos críticos en la determinación de la sensibilidad de la PCR. Incluso cuando el mismo gen se selecciona como diana, conjuntos de cebadores de PCR con diferentes saca de 100 a 1.000 veces la diferencia de sensibilidad entre los conjuntos de cebadores. Tanto, la secuencia de los cebadores es importante en la sensibilidad y especificidad de la PCR.