Práctica No. 1 “Aislamiento y caracterización de DNA”

...

Cabe mencionar que este paso fue el que consideramos tuvo más peso en las variaciones de concentración obtenidas. Por nuestra parte, la concentración de DNA fue baja (equipo 8, 665 μg/mL) comparada con la de otros equipos pues la recuperación de la fase acuosa fue compleja.

Otro aspecto importante es el uso del formol, sustancia que, por poseer anillos aromáticos, absorbe en una longitud de onda similar a la del DNA, presentando su mayor absorción a 269.5 nm, (López Alvarado, 2006), si no se eliminó completamente el fenol este puede alterar la absorbancia obtenida a 260 nm (incrementándola), hecho que provocará el aumento en el resultado de concentración obtenida. Esto pudo ocurrir en el equipo 12, justificando la gran diferencia entre los valores obtenidos por nuestro equipo y el antes mencionado (665 μg/mL- 2943.35 μg/mL, Tabla 1). En un gráfico más detallado del espectro de absorción del equipo 12, podríamos observar si existe una meseta en la absorbancia a 260nm, hecho que permitiría aceptar o descartar nuestra hipótesis.

Las diversas concentraciones de DNA extraído por cada equipo son proporcionales a la absorbancia a los 260nm, sin embargo en esta extracción se acarrearon proteínas, es por ello que en la pureza nos

Al ver la gráfica del espectro de absorción del DNA de Escherichia coli W3350 podemos deducir si tenemos gran cantidad de proteínas en nuestra muestra puesto que los enlaces peptídicos tienen su longitud de onda mínima a 230 nm y su máxima a 205 nm (Surzycki, 2003); vemos que a 230 nm sí tenemos una absorbancia pero esta es relativamente pequeña y puede ser propia del DNA (5.94), podemos descartar la presencia de proteínas mediante la relación de la absorbancia a 260 nm (longitud de onda de máxima absorbancia del DNA) sobre la absorbancia a 230 nm, resultado que es de 2.23, la bibliografía nos indica que ésta relación debería estar entre 1.8 - 2.0 (Surzycki, 2003), sin embargo, nuestro equipo obtuvo 0.23 más de lo esperado por lo que se podría decir que tenemos poca cantidad de contaminación (proteínas) en nuestra muestra. Si comparamos el espectro de absorción de la bibliografía (Figura 1) con el obtenido experimentalmente podemos ver que sigue el mismos patrón, aunque las unidades de absorbancia sean distintas, esto puede ser porque las concentraciones para realizar ambos espectros no fueron las mismas, sin embargo, como se mencionó anteriormente tenemos el mismo comportamiento, un pico máximo a 260 nm (la longitud de onda máxima del DNA), seguido de menor absorbancia a 280 nm y menor absorbancia a 230 nm.

La relación entre la absorbancia a 260nm y la absorbancia a 280nm, también nos permite dilucidar el grado de pureza del DNA aislado, pues la longitud de onda de máxima absorción de proteínas con aminoácidos que presentan grupos aromáticos en su estructura es de 280 nm, por ende si la relación A260/A280 está entre 1.8-2.0 podemos decir que la pureza del DNA es aceptable (Banco Nacional de DNA Salamanca), sin embargo, el valor obtenido supera por poco este intervalo (2.02, Tabla 1) hecho que podemos atribuir a contaminación con proteínas o la ínfima presencia de RNA, al usar un método enzimático para la eliminación del mismo, no se obtiene un 100% de eliminación pues depende de la concentración del sustrato (RNA) y de la enzima (Surzycki, 2003). Podemos descartar que este valor se deba a la presencia de RNA mediante electroforesis en gel.

Para estudiar la influencia de diferentes parámetros sobre la desnaturalización de oligonucleótidos empleamos el programa de DNAMAN en el cual presentamos tres casos distintos (Tabla 2):

- 3 oligonucleótidos con 40 residuos con diferentes relaciones de GC/AT donde se observó que conforme existía un menor porcentaje de CG, la Tm disminuía.

- 3 oligonucleótidos con 40 residuos con la misma relación GC/AT donde se observó que mientras se mantuviera la misma relación GC/AT, la Tm sería la misma sin importar que fueran diferentes secuencias de nucleótidos.

- 3 oligonucleótidos con diferentes longitudes en su secuencia, donde se observó que conforme se aumentaba la longitud de la secuencia de nucleótidos, la Tm de igual manera aumentaba.

Conclusiones

- Es posible aislar DNA cromosómico de Escherichia coli W3350 por el método de Marmur y Kirby.

- Se obtuvo el espectro de absorción esperado.

- Este método no proporciona una pureza en un rango muy cercano al aceptable.

- Entre mayor porcentaje de GC presente en el DNA, mayor será su temperatura de fusión media (Tm).

Bibliografía

- Chávez, M. (2012). Composición química del ADN. Recuperado de: http://composicionquimicadeladn.blogspot.mx/2012/10/adn.html?m=1 [Fecha de consulta: 2/02/2017]

- Surzycki, S. Human Molecular Biology. Melbourne, Australia: Blackwell Publishing. 2003, página 3-4

- Madigan, M., Martinko J. Brock.Biología de los microorganismos. Ed. Pearson educación, 14° edición. Madrid, 2015.

- López Alvarado (2006) Measurement of the pK of phenols and its aplication to the determination of QSAR-Related electronic parameters. Recuperado de: http://old.iupac.org/publications/cd/medicinal_chemistry/Practica-III-5.pdf [Fecha de consulta: 2/02/2017]

- https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/physical-sciences-practice/physical-sciences-practice-tut/e/melting-point-and-thermodynamics-of-double-stranded-dna-1 [Fecha de consulta: 2/02/2017]

- Banco de DNA Carlos III, Universidad de Salamanca. Recuperado de :

http://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf

[Fecha de consulta: 2/02/2017]