RESÚMEN: ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS NO DERIVADOS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE IONIZACIÓN

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Los resultados son similares a lo reportado en los estudios de fragmentación de informes relativos (Tabal 1, en trabajo de Piraud et al. (2003)), no obstante, se han observaron pequeñas diferencias en los fragmentos reportados o en su abundancia relativa. Algunos fragmentos de pequeño tamaño, no reportados en literatura, se obtuvieron con una tensión bastante alta CE (> 40 eV), una condición que trabajos anteriores no evaluaron. Las diferencias en las abundancias relativas de los iones, también puede ser debido a los valores de CE optimizados utilizados para los diversos fragmentos de nuestro estudio en lugar de los valores de CE comunes utilizadas por otras personas para todas las moléculas.

Mecanismos de fragmentación de AA se han estudiado ampliamente en el modo de ion positivo, y no se desarrollaron en el presente estudio. Se han observado fragmentaciones de AA característicos. Otros fragmentos sin características comunes pueden ser observados para muchas moléculas, lo que permite la posibilidad de transiciones específicas para estas moléculas, de acuerdo con su estructura.

La mayor parte de las moléculas eran capaces de dar muchos fragmentos de iones con una alta sensibilidad que parece compatible con la aplicación del trabajo en futuro. En teoría, una transición específica y sensible es suficiente para la detección de una molécula. Sin embargo, el conocimiento de dos (o más) transiciones puede ser de interés para confirmar los resultados cuantitativos obtenidos para la medición de AA en matrices complejas, sobre todo en presencia de compuestos de interferencia. Se seleccionó para cada molécula de la transición más sensible, y, a veces otro / o menos sensible pero más específica, en el caso de moléculas isobáricas.

Con el fin de evaluar la abundancia de ionización relativa de cada transición en los dos modos para cada molécula, el estudio de fragmentación se completó con la supervisión de cada molécula en un estudio FIA de (condiciones neutras y ácidas) positivos y (condiciones neutras) el modo de ionización negativo (Tabla 4). Las moléculas mal o no detectables en el modo positivo en condiciones neutras comparten grupos altamente electronegativos (carboxílico, fosfato, sulfato, ...). En condiciones neutras (metanol / agua), las moléculas se entregan a la fuente como zwitteriones, que probablemente limita su ionización. Cuando se re-investigó en 0,5 mM TDFHA (un agente de apareamiento iónico volátil utilizado con éxito en la separación y MS / MS de detección de AA28,36 no modificado), en condiciones ácidas, estas moléculas mostraron una señal mejorada, revelando así o mejorar su sensibilidad de detección. En la mayoría de los casos, la ionización negativa produce generalmente más pobres que hace la abundancia de ionización ionisation52-una razón más positiva a preferir el modo de ionización positiva para estudios posteriores. La hipótesis de que las condiciones alcalinas también pueden revelar o mejorar la ionización negativa ha sido considerado. Un corto estudio preliminar FIA mostró que la mejora de la abundancia de ionización era obvia para algunas moléculas en hidróxido de amonio 0,25%, pero no para todos ellos (datos no mostrados). Esto confirma que la composición de la fase móvil altamente puede modificar la intensidad de la señal, 52 y muestra que el comportamiento de diversas moléculas hacia las condiciones de fase móvil es molécula dependiente.

Las moléculas que se pueden detectar con la menor sensibilidad en modo positivo (Gly, Cys, Tau) tal vez serán los más difíciles de detectar en condiciones / MS / MS de LC. La determinación precisa del límite de detección (LOD) sólo es posible en el futuro sistema cromatográfico LC elegido. Sin embargo, una estimación aproximada del límite de detección en modo positivo por cada molécula se comprobó que oscila desde aproximadamente 0,1-0,2 pmol (Pip, Leu, Pro, Lys) a 30-40 pmol (Gly, Tau).

En condiciones fisiológicas, las concentraciones de plasma de AA están en el rango de 10 a 700 mM (correspondiente a 5-350 pmol inyectado para 1:10 diluyeron 5 ml de la muestra). Gly, que se detecta con la peor sensibilidad, es, sin embargo, presente en concentraciones que van de 200-1000 mM (100-500 pmol inyectado para uno y diez diluido 5 ml de la muestra) en el plasma o la orina. Por lo tanto, la detección de la mayoría de estas moléculas parece compatible con su investigación en el plasma y en la orina, incluso con una muestra diluida 1:10, y un 5 ml inyecta volumen, lo que permite el análisis en volúmenes de muestra muy reducidos. LOD estimación tiene que ser confirmado en el futuro método elegido, y en comparación con los valores habituales. Nuestro objetivo era obtener un análisis sola corrida LC / ESI-MS / MS de AA sin derivatizar. Debido a que todas las moléculas de interés (excepto PEA, Orot y orotidina) podrían ser detectadas en modo positivo, este modo de ionización fue retenida para los estudios posteriores. Entre las moléculas que se detectan en el método de análisis AA clásica, PEA es el único que no pudo ser detectada en ionización positiva MS / MS. Orot y orotidina no son detectados por la rutina de ninhidrina derivados method.1 una mejora real en la detección de otras moléculas (Pip, pGlu, Trp, GSH, GSSG...) Se puede esperar de este método ESI-MS / MS.

La detección de la AA exhibir mala sensibilidad en modo positivo será mejorado por el uso de otras condiciones LC-MS / MS ácidas (Tabla 4). Por el contrario, la composición de la fase móvil y de la matriz en la cual serán analizados podría conducir a una disminución de la señal, ya sea un fenómeno llamado supresión señal” o “supresión de iones “. Por lo tanto, la posibilidad real de detección y el límite real de detección de cada molécula sólo se pueden determinar en las condiciones de LC finales elegidos para el análisis. Las moléculas detectables solamente en el modo negativo deben ser estudiados en una ejecución específica por el uso de condiciones de LC apropiados, probablemente incluyendo una fase móvil alcalina adecuada.

La especificidad del método de MS / MS está vinculado a el análisis combinado del ión precursor y uno de sus fragmentos. Aunque esta técnica es mucho más selectiva que otros, cada molécula que puede dar la misma fragmentación constituye una interferencia cuando estas dos moléculas están presentes en la misma mezcla. Si se necesita la cuantificación mediante MS / MS, estas moléculas tendrán que ser separados antes del análisis. Los resultados muestran que el nivel de interferencia es muy variable, desde insignificante ( 15%), incluso más alta que la señal del analito. Moléculas que están mal detectados pueden sufrir particularmente de las