TERCER CURSO DEL GRADO EN BIOLOGIA.

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- Cultivo de células y obtención de extractos

- Las células NMuMG se cultivan en esterilidad en medio completo (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (v/v), L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 μg/ml 37°C y en atmósfera al 5% de CO2). Se establecen cultivos por triplicado: una placa se procesa cuando alcanza el 60-70% de confluencia; otra se retira al 100% de confluencia y la tercera se depriva de suero (FBS, fetal bovine serum) durante 24 h cuando alcanza el 70% de confluencia.

- Concluidos los tratamientos, se aspira el medio de cultivo y las placas se lavan con tampón PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM, KH2PO4 1.5 mM, pH 7.2).

- Las células se lisan durante 10 min a 4ºC con 0.5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, EGTA 2 mM, EDTA 2 mM, sacarosa 270 mM, β-glicerol-fostato 10 mM, pirofosfato sódico 5 mM, fluoruro sódico 50 mM, Tritón X-100 1% (v/v), ortovanadato sódico 0.1 mM, β-ME 0.1% (v/v), inhibidores de proteasas Complete™). Se recoge el lisado celular y se centrifuga a 14.000 rpm durante 30 min a 4ºC.

- El sobrenadante conteniendo las proteínas celulares totales se transfiere a un tubo nuevo y se almacena a -20ºC hasta su uso.

- La cantidad de proteína de los extractos se cuantifica empleando el método colorimétrico de Biuret y el kit comercial Coomasie Plus reagent (Pierce). La concentración de proteína se determina interpolando la absorbancia a 495 nm de las muestras en una recta patrón construida con cantidades conocidas de albúmina de suero bovino (BSA).

- Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

- Lavar, secar y montar los cristales que contendrán el gel de poliacrilamida.

- Preparar 10 ml de gel separador al 8% de poliacrilamida: 375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 8% acrilamida, 0.2% bis-acrilamida, 2 mM EDTA, 0.1% SDS. Añadir inmediatamente antes de polimerizar el gel 0.1 % TEMED, 0.1% persulfato amónico. Tras depositar el gel dentro de los cristales, cubrir con una fina capa de agua para obtener un frente recto. Dejar polimerizar durante 30 min.

- Preparar 5 ml de gel concentrador al 4% de poliacrilamida: 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% acrilamida, 0.11% bis-acrilamida, 2 mM EDTA, 0.1% SDS. Añadir inmediatamente antes de polimerizar el gel 0.1 % TEMED, 0.1% persulfato amónico. Tras depositar el gel dentro de los cristales, colocar el peine de 10 pocillos y cubrir con una fina capa de agua. Dejar polimerizar durante 30 min.

- Retirar el peine con mucho cuidado de no distorsionar la forma de los pocillos. Colocar el gel dentro de la cubeta y añadir dentro de la misma unos 800 ml de tampón de electroforesis TBS: Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0.1% (p/v). El tampón debe cubrir tanto la zona de los pocillos (polo negativo) como la parte inferior del gel (polo positivo).

- Poner en un volumen de 25 μl: extracto proteico celular hasta 25 μg y tampón de carga (Tris-HCl 62.2 mM pH 6.8, SDS 10% (p/v), glicerol 50% (v/v), azul de bromofenol 0.025% (p/v), β-ME 20% (v/v)). Incubar a 100ºC durante 5 min y dejar enfriar a RT.

- Cargar las muestras desnaturalizadas (25 μl) en los pocillos del gel. Desarrollar la electroforesis a 50 V hasta que el frente de las muestras entre en el gel separador (inferior) e incrementar el voltaje a 100 V hasta el final de la migración. Cargar una calle con 10 μl de marcadores de peso molecular pre-teñidos Detener el proceso cuando el frente azul se encuentre próximo al final del gel.

- Transferencia Western

- Desmontar los cristales con cuidado de no romper el gel.

- En una cubeta conteniendo tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM, metanol 20% (v/v)) colocar sobre la parte oscura del módulo perforado (polo positivo) los siguientes elementos en este orden: esponja, 2 piezas de papel, membrana de nitrocelulosa, gel de poliacrilamida, 2 piezas de papel, esponja. Cerrar el módulo, introducirlo en la cubeta de transferencia y llenar con tampón de transferencia.

- Transferir toda la noche a una intensidad de 100 mA a 4°C.

- Inmunodetección y cuantificación

- Desmontar el módulo de transferencia y separar la membrana del gel. Incubar la membrana de nitrocelulosa en solución Pounceau S (Ponceau S 0.5% (p/v), ácido acético 5% (v/v)) a RT durante 10 min. Eliminar el exceso de colorante lavando con agua destilada y marcar las calles y las bandas correspondientes a la calle de los marcadores de peso molecular.

- Utilizando una hoja de bisturí recortar el fragmento de membrana correspondiente a 30 kDa (PCNA). Recortar también la zona de 45 kDa para aislar la proteína β-actina que será utilizada como control de carga y de integridad del extracto proteico. Lavar con agua hasta eliminar totalmente el Pounceau S.

- Bloquear las membranas en una solución de TBS-T (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 75 mM, Tween-20 0.2% (v/v)) conteniendo leche desnatada o al 5% (p/v) durante 2 h a RT.

- Lavar la solución de bloqueo con TBS (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 75 mM) e incubar cada membrana por separado en esta misma solución toda la noche a 4°C con los siguientes anticuerpos primarios: PCNA a una dilución 1:100 y β-actina a una dilución 1:1000.

- Eliminar el exceso de anticuerpo primario con 3 lavados de 10 min cada uno en TBS-T con agitación.

- Incubar con los anticuerpos secundarios siguientes durante 45 min a RT en TBS: membrana PCNA con anti-mouse a una dilución 1:10.000 y membrana β-actina con anti-rabbit a una dilución 1:20.000.

- Eliminar el exceso de anticuerpo secundario con 3 lavados de 10 min cada uno en TBS-T con agitación.

- Hacer un lavado final en TBS y añadir a cada membrana una cantidad de reactivo de revelado (luminol femto, Pierce) necesario para cubrirlas (aprox. 0.5 ml). Incubar en semioscuridad durante 5 min.

- Eliminar el exceso de reactivo y cubrir las membranas con plástico transparente. Exponer y escanear en el equipo Image Quant (GE). Cuantificar la intensidad de la señal de expresión proteica. Normalizar la expresión de PCNA por la de β-actina y realizar una representación gráfica.

PRACTICA 3: ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR

En esta práctica se llevará a cabo un ensayo de viabilidad celular tras someter a las células a un tratamiento que induce muerte celular. Se emplearán células de neuroblastoma humano SH-SY5Y y como agente