Teoria segmental C Fos

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Que es c-fos? Los genes de expresión rapida, descritos originalmente en el campo d ela regulación del crecimiento, son rapidamente inducidos por un estimulo extracelular y codifican proteinas que son requeridas para eventos subsecuentes dentro de la celula (Curran & Morgan, 1995). El primero de estos genes en describirse fue el c-fos, que codifica la proteina Fos que participa con productos relacionados con la familia de la proteina Jun, como componente de un complejo proteico que se une al activador proteico 1 (AP-1) en el sitio d eunion en el ADN (Curran 6 Teich, 1982; Lee et al, 1988; Sheng & Greenberg, 1990). Los genes que contienen el complejo AP-1 son activados por el complejo Fos/Jun, permitiendo la expresión de los llamados genes de expresión tardía, que codifican productos neuronales diferenciados, como los neurotransmisores. La transcripción de c-fos ocurre pocos minutos después de la aplicación de un estimulo, con un ppico maximo de mRNA a los 30-45 minutos y una vida media de la proteina Fos de cerca de 2 horas (Müller et al, 1984).

La expresión del cfos en las neuronas ha proporcionado un util y popula marcador para las neuronas activadas. Su expresión basal es baka en la mayoria de las neuronas (Hedengen et al, 1995; Krukoff & Khalili, 1997), pero puede ser rapidamente inducida por un amplio rango de estimulos. La forma mas comun es la visualizacion de la presencia de fos dentro de los núcleos de las neuronas usando inmuno histoquímica mientras que los niveles de mRNA para el gene pueden ser medidos con hibridizacion in situ, Northern blots y otras. Además, de la manera facil y de relativo bajo costo utilizada para demostrar y contar las neuronas marcadas, la inmuno histoquimica con Fos permite al investigador preguntas relativas a las neuronas individuales que participan en una funcion fisiologica especifica.

Metodo:

Aplicación del estimulo:

Consideraciones de Importancia

Los anestesicos tienen un efecto importante sobre la expresión de Fos en las neuronas, algunos anestesicos como el pentobarbital sodico y la ketamina suprimen la expresión de Fos, y otros, como el uretano, α-cloralosa, o metoxifluorano, estimulan la expresión de Fos (Marosa et al, 1992; Krukoff, 1993; Wakayama et al, 1994). Para evitar los efectos secundarias por la anestesia, es recomendable realizar los experimentos con animales conscientes. Por otro lado, el estrés causado por la manipulación o el enjaulamiento (Cecatelli et al, 1989; Melia et al, 1994, Cullinan et al, 1995; Krukoff & Khalili, 1997), o aun la exposición a ambientes nuevos (Handa et al, 1993) son por si mismo potentes estimulos para la expresión de Fos. Estos efectos pueden ser reducidos de manera notoria por la exposición de los animales de experimentación a condiciones de ambiente y manipulación diariamente por lo menos de la semana previa a la fecha de las pruebas de experimentación. De esta manera el animal podria estar habituado a las condiciones del experimento. La estricta consideración de estos factores permitirá al investigador eliminar el efecto de los factores externos sobre los resultados de las pruebas.

TIPO Y DURACION:

El c-fos se expresa varios minutos después de la aplicación del estimulo y la proteina puede ser detectada inmuno histoquimicamente en los siguientes 15-30 minutos. La mayoria de las publicaciones describen estimulos aplicados de 3º minutos a varias horas, siendo una hora el periodo mas comúnmente usado. Krukoff utiliza estimulos por 60-90 minutos (Krukoff et al, 1995; Petrov et al, 1995b).

La aplicación cronica de estimulos por dias o mas puede no resultar la presencia de Fos al final de la prueba, ya que la expresión de c-fos se presenta solo después que el estimulo inicial es aplicado. Una vez que AP-1 se situa sobre un gene ha sido activado, la activacion continua puede resultar innecesaria o suprimida y la expresión de c-fos puede terminar. Los efectos de las enfermedades cronicas del cerebro sobre la activacion neuronal no han probado tener éxito. La mejor guia es un experimento piloto para probar si un estimulo cronico produzca la expresión de c-fos.

Preparacion de tejidos

Consideraciones importantes:

Una vez concluido el experimento, el animal de experimentación debe ser profundamente anestesiado con el anestesico adecuado. Como algunos anestesicos tienen efectos negativos sobre la expresión de Fos en el cerebro, es importante mantener la profundidad de la anestesia antes de la fijación minima. Una anestesia que no exceda los 10 minutos es suficientemente satisfactoria para evitar los artefactos inducidos por ella.

Postfijacion (después de la perfusion) es un paso comun usado en la histologia standart y la inmuno histoquimica. Para la inmuno histoquimica de Fos es recomendable no prolongar mas de una hora la posfijación en el medio fijador debido a que la fijación prolongada dismninuye la reactividad inmunolofica de Fos.

Las secciones pueden ser procesadas de forma libre (free-floating) o thaw-mounted tisúes. Las secciones deben ser lo mas grueso de los dos tipos (25-60 micras vs 5-20 micras) para que los tejidos puedan ser manipulados. No obstante el mayor espesor, los mejores resultados inmuno histoquimicos son generalmente mas nitidos en el free-floating porque las soluciones tienen acceso a ambas caras del corte.

Preparacion del tejido

- Perfundir aproximadamente 100 ml de solucion salina a traves del ventriculo izquierdo cardiaco para desplazar la sangre.

- Perfundir con 500 ml de paraformaldehido al 4% enfriada con hielo en fosfato buffer salino (PBS) 0,1 M, pH 7,2. para preparar la fijación, humedecer 20 gr de paraformaldehido en 100-150 ml de agua destilada. Calentar a 60ºC, agitando constantemente. Aclarar la solucion con NaOH 5-10 N añadido gota a gota. Filtrar y completar hasta 500 ml con PBS.

- Remover el cerebro y ubicarlo en el medio de fijación: 10% sucrosa (en agua). Despues de una hora, tranferir el cerebro a sucrosa 10%. Aproximadamente 12 horas después ubicar el cerebro en 20 y 30% de sucrosa. La sucrosa desplaza el agua de los tejidos y reduce los artefactos por la congelación durante los cortes.

- Cortar secciones en un criostato (-20ºC). Para el proceso de free floating, las secciones de cortes de 25 – 60 micras de grosor y recogidas en PBS 0,1 M (pH 7,2). Para el proceso thaw-mounting los cortes seran de 5-20 micras-

Tincion Inmuno histoquimica