Un modelo de sitio de fosforilación Regulado

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Los anticuerpos para p70 S6k fosforilados en Thr389, PKB-fosforilada Thr308, fosforilados ERK1 / 2, y PKB (total) fueron de Señalización Celular Tecnología (Hitchin, Hertsfordshire, Reino Unido). Los anticuerpos para eEF2 quinasa fosforilada en Ser366 se han descrito anteriormente (25, 26) y fueron proporcionados por Jane Leitch, División de Señal Terapia Transducción de la Universidad de Dundee. Los anticuerpos contra TSC2 también fueron proporcionados por Leitch. Los anticuerpos frente a los a1 y a2 subunidades de AMP-activated proteína quinasa (AMPK) y a acetil-coenzima A carboxilasafosforilada en Ser79 fueron amablemente proporcionados por Hardie DG, Universidad de Dundee. El anticuerpo anti-FLAG (M2) fue de Sigma. Los antisueros de 4E-BP1, S6K1, eEF2 fosforilada en Thr56, el total de eEF2 y fosfo-Ser235 rpS6 se describió previamente (7). Inmunoglobulina de conejo anti-oveja anticuerpos de inmunoglobulina G de cabra anti-conejo y G, tanto conjugado con peroxidasa, se obtuvieron de PerbioScience Ltd. (Tattenhall, Reino Unido).

Células y cultivo celular.

Células KB (células de carcinoma epidermoide orales humanos) se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% (vol / vol) de suero de ternero fetal, 100 U de la penicilina por ml, y 0,1 mg de estreptomicina por ml. Antes del tratamiento hormonal, las células fueron cultivadas a 90% de confluencia y luego se mueren de inanición de suero durante la noche. Fibroblastos de embriones de ratón (TSC2 + / + o TSC2 - / -) (24, 52) se cultivaron en DMEM que contenía 10% (vol / vol) de suero de ternero fetal, 100 U de penicilina por ml, y 0,1 mg de estreptomicina por ml. Antes del tratamiento hormonal, las células fueron cultivadas a 90% de confluencia y luego se mueren de inanición de suero durante 3 h.Células CHO.K1 y las células madre embrionarias (ES) fueron cultivadas y tratadas como se describió previamente (7, 50). Antes del tratamiento hormonal, las células ES se mueren de inanición de suero durante 4 h.Cuando se usa, se añadieron inhibidores de la señalización 30 min antes de la adición de 100 nM de insulina durante 30 min. Para aminoácidos hambre, las células CHO.K1 KB o se transfirieron a solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco o solución de sales equilibradas de Earle, respectivamente. Ambos medios contienen d-glucosa a una concentración de 1 g por litro.

La transfección de células KB se llevó a cabo utilizando el sistema de transfecciónGenePORTER 2 (Cambridge Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con 10 g de ADN de plásmido por 10 cm de placa de cultivo celular

Preparación y análisis de extractos celulares.

Las células se extrajeron en tampón que contiene 50 mM β-glicerofosfato (pH 7,5), 1 mM EGTA, EDTA 1 mM, 1% (vol / vol) Triton X-100, 1 mMNa 3 VO 4, 100 nMmicrocistina-LR, 0,1 % (vol / vol) β-mercaptoetanol, e inhibidores de proteasa (leupeptina, pepstatina, antipaína y, cada uno a una concentración de 1 g / ml, y 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Los lisados ​​se centrifugaron a 13.000 rpm en una microcentrífugaEppendorf 5415D para eliminar los residuos. Las concentraciones de proteína en los sobrenadantes resultantes se describen como anteriormente (8). Se retiraron los sobrenadantes a tubos nuevos y luego girar a 4 ° C en presencia de proteína G-Sepharoseprebound con anti-FLAG o anticuerpo anti-total de eEF2 quinasa, según sea apropiado. Los complejos inmunes se lavaron cuatro veces con tampón de extracción y se resuspendieron en tampón de muestra de dodecilsulfato de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

Para CaM-eEF2 experimentos coimmunoprecipitation quinasa, los procedimientos de extracción y de inmunoprecipitación se llevaron a cabo mediante el uso de un tampón de extracción que contiene calcio modificado (HEPES 50 mM, pH 7,5; 50 mM β-glicerofosfato; NaCl 50 mM; 1 mMCaCl 2; 0,3% , en peso / vol, 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato [CHAPS]), 1 mMNa 3 VO 4, 100 nMmicrocistina-LR; 0,1% (vol / vol) β-mercaptoetanol, e inhibidores de proteasa (leupeptina, pepstatina, antipaína y, cada uno a una concentración de 1 g / ml, y 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) a fin de mantener la interacción eEF2 quinasa-CaM.

La electroforesis en gel y transferencia Western de los lisados ​​y los inmunoprecipitados se realizaron como se ha descrito anteriormente (36) mediante el uso de una membrana Immobilon, excepto que para el análisis de 4E-BP1, correr geles que contienen 13,5% (peso / vol) acrilamida y 0,36% (peso / Se emplearon vol) bis-acrilamida de metileno. Las transferencias fueron desarrollados por un aumento de quimioluminiscencia.

Anticuerpos fosfoespecífico para eEF2 quinasa.

El antisuero para eEF2 quinasa fosforilada en Ser78 se planteó en conejos mediante el uso de los péptidos GSPANSpFHFKEC, donde Sp indica fosfoserina. El péptido se sintetizó por Graham Bloomberg (Universidad de Bristol, Reino Unido), acoplado a hemocianina de lapa californiana, y se inyecta en conejos a Diagnósticos Escocia (Edimburgo, Reino Unido). Los anticuerpos se purificaron por afinidad en columnas de antígeno-Sepharosefosfopéptidos y se utilizaron a una concentración de 0,5 mg / ml en presencia del péptido no fosforilado correspondiente (10 g / ml). Los anticuerpos contra el total de quinasa eEF2 se plantearon en contra expresada en bacterias glutationtransferasa (GST) -eEF2 quinasa en conejos a Diagnósticos Escocia y luego afinidad purificados en maltosa unión a proteínas eEF2 quinasa-Sepharose para eliminar los anticuerpos anti-GST.

La mutagénesis de eEF2 quinasa.

Un cDNA modificado que codifica la quinasa eEF2 humano con una etiqueta FLAG N-terminal clonado entre los sitios BamHI del vector pGEX-4T fue proporcionado amablemente por MariaDeak de la División de la señal Terapia Transducción de la Universidad de Dundee. La mutagénesis de Ser78 a alanina se realizó por PCR utilizando QuikChange (Stratagene). El cebador directo fue 5'-CGGCAAACGCCTTCCACTTCAAGGAAGCC-3 ', y el cebador inverso fue 5'-GGCTTCCTTGAAGTGGAAGGCGTTTGCCG-3'. La plantilla utilizada era la quinasa vector pGEX-4T-eEF2.Para la transfección de células KB, de tipo salvaje o mutante quinasa humana eEF2 marcado con FLAG se subclonó en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1 mediante el uso de los sitios BamH1 cada lado de la pieza de inserción.

Los ensayos para eEF2 quinasa

eEF2 quinasa se ​​ensayó como se ha descrito anteriormente (40) con las siguientes modificaciones.