La activación del metabolismo y de la membrana de la perturbación.

...

2. Materiales y métodos

2.1. materiales

Todos los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).Citrato de sangre humana fresca fue obtenida de donantes sanos informados que declararon que habían abstenido de todos los tratamientos con fármacos durante al menos una semana antes de la recogida de muestras, de conformidad con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki. Solución madre concentrada de CPZ se preparó disolviendo el fármaco en etanol. Sobre la base de las concentraciones CPZ observados in vivo a dosis terapéuticas, las concentraciones de fármaco gama elegidos para experimentos seleccionados fue 10-100 μ M.

2.2. Preparación de los eritrocitos

Muestras de sangre de citrato se lavaron tres veces con una solución de NaCl isoosmótica. Durante el lavado, las células blancas de la sangre fueron descartados a partir del sedimento. Después del lavado, los glóbulos rojos se resuspendieron (hematocrito 3%) en el tampón de incubación (35 mM Na 2 SO 4, NaCl 90 mM, HEPES 25 mM [N- (2-hidroxietil) piperazina-N1-2-etanosulfónico], y 1,5 mM MgCl 2 ), se ajustó a pH 7,4 o 7,3 y 310 ± 20 mOsmol por kg, medida por un aparato osmostato OM-6020 (Daiichikagakuco, Kyoto, Japón). En experimentos realizados con eritrocitos de desoxigenación, diferentes niveles de desoxigenación (desde 15% hasta 90%) se verificaron mediante la determinación de Hb saturación espectrofotométricamente (Beckman DU 640 espectrofotómetro) usando las absortividades milimolar reportados por Zijlstra et al. [ 22 ]. El tampón utilizado para preparar eritrocitos desoxigenadas era 0,1 unidades de pH menor que la usada para los eritrocitos oxigenados, con el fin de compensar el efecto Haldane que se produce durante la desoxigenación [ 23 ]. Metahemoglobina (Met-Hb) y el grado de hemólisis se determinaron al final del tiempo de incubación según lo informado por Zijlstra et al. [ 22 ].

2.3. mediciones cinéticas

Las células se incubaron en el tampón de incubación anterior a 25 ° C, bajo diferentes condiciones experimentales en presencia y ausencia de CPZ en concentraciones que van desde 50 hasta 150 μ M. En varios intervalos de tiempo (5, 15, 30, 60, 90 y 120 min), 10 μ mol del medio de parar SITS (4-acetamido-40-isothiocyanostilbene-2,20-disulfónico) se añadió a cada tubo de ensayo que contiene la suspensión de RBC a intervalos de tiempo periódicos.Las células se separaron del medio de incubación por centrifugación (J2-HS Centrifugar, Beckman, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se lavaron tres veces a 4 ° C con un medio libre de sulfato para eliminar el sulfato de atrapado en el exterior.Después del lavado final, las células concentradas se lisaron con ácido perclórico (4%) y agua destilada. Los lisados ​​se centrifugaron durante 10 min a 4000 × g (4 ° C) y las membranas se separaron del sobrenadante. Iones de sulfato se precipitaron a partir del sobrenadante mediante la adición de una mezcla de glicerol / agua destilada (1: 1, V / V), 4 M NaCl y HCl 1 M, y 1,23 M BaCl 2 · 2H 2 O para obtener un precipitado de sulfato de bario homogénea. La absorbancia de esta suspensión se midió en 350 a 425 nm. Concentración de sulfato se determinó utilizando una curva estándar calibrado, obtenida por medición de la absorbancia de las suspensiones con cantidades conocidas de sulfato de [ 24 ]. Los datos experimentales sobre la concentración de sulfato como una función del tiempo de incubación se analizaron utilizando la siguiente ecuación: c ( t ) = c ∞ (1 - e - kt ), donde c ( t ) representa la concentración de sulfato en el momento t , c ∞ es concentración de sulfato intracelular en el equilibrio, y k es la constante de velocidad de afluencia sulfato.

2.4. Determinación CPZ intracelular

Los glóbulos rojos lavados se incubaron a 37 ° C durante 2 h con 100 μ M CPZ en el tampón de incubación anteriormente. Las muestras se lavaron y las células empaquetadas se lisaron con 10% de etanol. Los lisados ​​se centrifugaron durante 10 min a 4000 × g (4 ° C) y el sobrenadante se filtró con un filtro de PTFE de 0,45 mm. CPZ libre se analizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un sistema Shimadzu, que consiste en un sistema de LC-10AD de la bomba y un detector de red de diodos SPDM10A, un inyector Rheodyne 7725i con un ml de bucle 20 de la muestra, y una de fase inversa Supelco C18 columna (5 mm, 250 x 4,6 mm). La fase móvil fue acetonitrilo: agua (70: / v 40 v). El caudal fue de 1,0 ml / min a 25 ° C. CPZ se detectó a 286 nm y se determina por comparación de las áreas de los picos con una solución estándar de 100 μ M CPZ.

2.5. Medición de la Intra-ATP extracelular

ATP se midió por la técnica de luciferina-luciferasa [ 19 , 25 ] en el que la cantidad de luz generada por la reacción de ATP con extracto de cola de luciérnaga depende de la concentración de ATP. La sensibilidad se ve aumentada por la adición de D-luciferina al extracto de cola de luciérnaga crudo sintético.Una muestra de 200 ml de la suspensión de RBC se inyectó en una cubeta que contiene 100 ml de extracto de cola de luciérnaga en bruto (10 mg / ml de agua destilada, FLE 250; Sigma-Aldrich) y 100 ml de una solución de D-luciferina sintética (50 mg / 100 ml de agua destilada; Sigma-Aldrich). La luz emitida se detectó utilizando un luminómetro (1251 Bio Orbit luminómetro). Una curva estándar se obtuvo en el día de cada experimento. Para ATP liberado de las células, después de CPZ 50 μ M de incubación, los eritrocitos se diluyeron 1: 100 y se incubaron con el activador directo de Gi, mastoparán 7 (4 μ M Mas 7).Para medir el ATP intracelular total de eritrocitos todos los procesos que consumen ATP fueron bloqueados desproteinización muestras con ácido tricloroacético (TCA). ATP se midió como se ha descrito anteriormente, después de la dilución de TCA al 0,01% con el fin de evitar la interferencia con el ensayo. Los valores se normalizaron a la concentración de ATP por eritrocito.

Para excluir la presencia de hemólisis significativa en estudios en los que se midió la liberación de ATP, las muestras se centrifugaron a 3000 × g a 4 ° C durante 5 min y la presencia de libre Hb en el sobrenadante se determinó por absorción de luz a una longitud de onda de 576 Nuevo Méjico.

2.6. Medición de la hemólisis

La hemólisis de los eritrocitos se determinó espectrofotométricamente a 576 nm basado en la relación de Hb libera de las células para el contenido de Hb celular total