LABORATORIO N°3. EXTRACCION DE ADN GENOMICO A PARTIR DE LINFOCITOS HUMANOS POR PRECIPITACION DE SALES (SALTING OUT)

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Imagen #7 (paso 3, agregar buffer de lisis II)

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Imagen #8 (paso 3, agregar SDS)

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Imagen #9 (paso 3, agregar perclorato de sodio NaClO4)

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Imagen #10 (paso 3, vortex por 10 seg)

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Imagen #11 (paso 4, agregar NaCl 6M)

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Imagen #12 (paso 4, vortex)

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Imagen #13 (paso 4, centrifugación)

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Imagen #14 (paso 4, “DNA disuelto”)

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Imagen #15 (paso 4, agregarlo a un microtubo)

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Imagen #16 (paso 5, agregue isopropanol)

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Imagen #17 (paso 5, visualizar fibras de DNA)

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Imagen #18 (paso 5, agregue buffer TE)

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Imagen #19 (paso 5, rotular muestra)

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Imagen #20 (paso 5, retirar fibras de DNA)

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Imagen #21 (paso 5, lavar DNA con etanol 70%, tapar)

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Imagen #22 (paso 5, refrigerar hasta cuantificar)

DISCUSIONES

Al momento de realizar cada uno de los pasos se pudo apreciar cómo se iban obteniendo resultados de acuerdo a los esperados, aunque en algunas ocasiones ciertos volúmenes en algunos grupos no fueron los correctos debido al mal manejo que se le dio ya sea a las micropipetas o al momento de adicionar o sacar líquidos o soluciones con la pipeta Pasteur, otro de los posibles errores fue quizás los tiempos que se dieron a la centrifuga puesto que el botón celular no se logró formar en varios de los tubos de diferentes grupos. Es por ello, que estos errores se vieron reflejados en algunas muestras ya que cuando se procedía a sacar las fibras de ADN de los tubos no se observaba nada y por lo tanto no se podría continuar el siguiente laboratorio el cual sería el de electroforesis, porque para ello se necesitaría la muestra y allí es donde nos daremos cuenta si realmente las fibras que se pudieron obtener fueron las correctas y también si el procedimiento se llevó a cabo de la mejor manera.

CUESTIONARIO

- ¿Qué función tiene cada uno de los reactivos utilizados en el procedimiento?

- BUFFER LISIS. La solución Tris, o tri (hidroximetil) aminometano, es una solución buffer biológica común que se utiliza en todo el proceso de extracción de ADN ya que este es sensible al pH de cualquier tipo de fuentedurante dicho proceso. La solución Tris se utiliza durante la lisis celular, la eliminación y la precipitación de componentes celulares no deseados para mantener un pH estable. Además, desempeña un papel particularmente importante en la lisis celular.

La solución Tris como buffer. Como el pH puede influir y ser influido por un número de factores celulares, mantener un pH estable es esencial para la ciencia experimental. Los buffers biológicos, como la solución Tris, son importantes porque pueden mantener un pH estable a pesar de las influencias que podrían modificar el pH. El Tri (hidroximetil) aminometano, con un pKa de 8,1, es una solución buffer eficaz con un pH de entre 7 y 9. Debido a su rango neutro, la solución Tris es una solución buffer comúnmente utilizada en los laboratorios biológicos. Sin embargo, la solución reguladora Tris es sensible a la temperatura y debe ser utilizada en la temperatura a la cual se logró el pH original para evitar inexactitudes.

Lisis de las células. La lisis, o ruptura de las células, es el primer paso para la extracción del ADN. Esto se logra mediante el uso de una solución buffer que contenga solución Tris y EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético). El EDTA se une a cationes divalentes tales como el calcio y el magnesio. Dado que estos iones ayudan a mantener la integridad de la membrana celular, la eliminación de estos con EDTA desestabiliza la membrana. La solución Tris es el principal componente buffer; su función principal es la de mantener el pH del buffer en un punto estable, por lo general 8,0. Además, la solución Tris interactúa con el LPS (lipopolisacárido) de la membrana, lo cual sirve para desestabilizar la membrana aún más.

La solución Tris Protege al ADN de los cambios en el Ph. Cuando las células se rompen, su ADN y contenido se vierten en el buffer. A menudo se incluyen además, la ARNasa (destruye el ARN), las proteasas (destruye las proteínas), y el SDS (dodecilsulfato sódico, solubiliza los fragmentos de membrana). En conjunto, este caldo de contenido celular y fragmentos de ARN y proteínas puede tener un gran impacto en el pH de la solución. Debido a que el ADN es sensible al pH, es importante que la solución Tris regule el caldo y mantenga el pH en un valor fijo. (español)

- SDS: El ADN no flota libremente dentro del núcleo de una célula. Está asociado con un gran variedad de proteínas y está revestido en una membrana celular. En las células animales, el ADN también está contenido en una membrana nuclear. Para poder extraer el ADN de una célula, primero deben retirarse las membranas y proteínas asociadas, y después separarse de manerafísica del ADN. El sodio puede estar dentro de muchos de los pasos para lograr esta meta.

Sodio como detergente.

El sodio es un elemento. Su símbolo químico es Na por Natrium, la palabra en latín para el sodio. Es un ion positivo y a menudo se asocia con iones negativos como parte de compuestos prácticos. Por ejemplo, cuando los iones del sodio se unen con los iones del cloro, hacen el compuesto cloruro de sodio, que es la sal de mesa.