CARACTERIZACIÓN QUIMICA DE LIPIDOS

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- PRECAUCIONES:

- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

- En una cámara cromatográfica coloque aproximadamente 5 mL de una solución de n-hexano: éter etílico: ácido acético glacial (70: 25: 1), deje saturar el frasco por lo menos 20 minutos.

Preparación de la muestra

- Coloque en un mortero aproximadamente 4 g de yema de un huevo cocido.

- Agregue 20 mL de una solución de etanol: éter: cloroformo (2:1:2)

- Macere suavemente y filtre a través de papel filtro, recogiendo el filtrado en un vaso de precipitados.

- Evapore el solvente sobre baño de maría, agitando el vaso constantemente, hasta tener el extracto viscoso o seco (tenga cuidado de evitar ebullición del solvente, recuerde que el éter es altamente inflamable).

- Una vez seco, redisuelva la muestra en 10 mL de éter, y luego adicione 30 mL de acetona. Se formara un precipitado, deje decantar colocando el vaso de precipitados en forma diagonal.

- Tome la fase líquida y colóquela en un vaso de precipitado de 50 mL, caliente en baño maría hasta reducir el volumen a 10 mL (Solución 1).

- Seque la fase solida en baño de maría, y redisuelva el sólido en 10 mL de éter etílico (Solución 2).

- Separe 1 mL de la solución 1 y 1 ml de la solución 2 para la cromatografía.

Pruebas cualitativas de composición de lípidos

- Tome en 3 tubos de ensayo diferentes 1 mL de solución 1, de solución 2 y de solución de lecitina (control positivo). A cada tubo adicione 1 mL de molibdato de amonio y 1 mL de ácido sulfúrico concentrado lentamente por las paredes del tubo; agite deje reposar por 3 minutos y adicione 1 mL de acido ascórbico. Prepare un cuarto tubo de ensayo con molibdato, ácido sulfúrico y ácido ascórbico (control negativo). Observe y anote.

- Tome 1 mL de solución 1, de solución 2 y de glicerina (control positivo). Agregue una cantidad pequeña de KHSO4 a los tres tubos anteriores y a un cuarto tubo vacío (control negativo). Caliente levemente cada tubo a la llama y note el olor desprendido en cada tubo.

- Tome 1 mL de solución 1, de solución 2 y de solución de colesterol (control positivo). Agregue 3 mL de FeCl3, y 1 mL de ácido sulfúrico concentrado a los tres tubos anteriores y a un cuarto tubo vacío (control negativo). Observe y anote.

Separación de lípidos por cromatografía en capa fina

- Sobre la placa cromatográfica marque con un lápiz suavemente trace una línea dejando una distancia de 1 cm desde la base de la placa.

- Con un capilar siembre 10 veces cada una de las muestras sobre la placa según la siguiente figura:

[pic 2]

Línea 1: Solución 1.

Línea 2: Solución 2.

Línea 3: Patrón de Colesterol.

Línea 4: Patrón de Lecitina.

Línea 5: Aceite de Oliva.

- Asegúrese de marcar cada punto sembrado.

- Coloque la placa en la cámara, tápela y deje el tiempo suficiente la placa hasta que la fase móvil este a 1 cm de la parte superior de la placa.

- Saque la placa y marque con lápiz la zona hasta donde llegó la fase móvil.

- Deje secar la placa, y aplique la solución reveladora (Sulfato de Amonio 10%)

- Deje secar y coloque la placa sobre una plancha de calentamiento a 70°C y retírela una vez se empiecen a revelar colores sobre esta.

- Determine el Rf para cada muestra.

SEGÚN EL DESARROLLO EXPERIMENTAL REALICE LAS SIGUIENTES ACTIVIDADES:

Discuta sobre la composición de lípidos del huevo según la caracterización cualitativa y el patrón obtenido en la cromatografía.

- BIBLIOGRAFÍA SUGERIDA:

Bohinski R. Bioquímica. Ed. Fondo Educativo Interamericano, 1992

Horton, Principios de Bioquímica, Pearson, 2008.

Voet D., Biochemistry, Willey & Sons, 2008.