CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DEL GRUPO DE SANGRE EN ABO EN NEANDERTALES

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estéril, incluyendo batas, mascarilla, careta y guantes) e inmediatamente congelado, antes de enviarlos a los laboratorios de ADN antiguo dedicados en Barcelona y Leipzig, donde se realizaron extracciones de ADN. Alrededor de 500 mg de hueso cortical se eliminó, en polvo y se extrajeron como se describe.

El análisis de loci de ADN nuclear específico de la antigua Neanderthal permanece por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una tarea difícil tailandés presenta dos limitaciones principales: la pequeña cantidad y corta longitud de los fragmentos de ADN antiguo debido a la degradación de las moléculas plantilla originales y la dificultad para distinguir entre el ADN neandertal endógeno y supuestos contaminantes humanos modernos contemporáneos. Sin embargo, la presencia de sustituciones informativos individuales en el gen ABO permite la caracterización de los diferentes alelos incluso cuando recuperación de secuencias cortas de ADN. Además, la amplificación co del ADN mitocondrial (ADNmt) y marcadores nucleares nos permite controlar la presencia de contaminación humana en los extractos.

De dos pasos PCRs multiplex] 23] en un volumen total de 20 ul se establecieron y se incubó durante] 0 minutos a temperatura ambiente con 0,5 unidades de camarón Nuclease (Biotec Phar-Macon *) para degradar cualquier ADN de doble cadena que pueda contaminar los reactivos 124J. Después de la desactivación de la nucleasa durante 30 minutos a 65 ° C, se añadieron 5 pi de extracto y Taq-Gold ADN polimerasa para la PCR. Veinte y siete ciclos de PCR se realizaron en la primera PCR y 33 ciclos en la segunda PCR. Las condiciones de reacción fueron como se describe [24] a excepción de la temperatura de recocido, que era 53-55 ° C, dependiendo de los cebadores utilizados.

La posición A261 informativa en el exón 6 se amplificó con el F20144-AGGAAGGATGTCCTCGTGG, R20163-TGCCCTCCCAGACAATGG par de cebadores (numerados de acuerdo con el GenBank RefSeq AY268591). La posición 297 en el exón 6, recuperada más para determinar a cuál de los dos haplotipos S principales (O01 O02) o las muestras pertenecían, se amplificó con el cebador pareja F20173-TTGGCT-GGCTCCCATTGTCTGG, R20194-GAACTGCTCGTTGAGGATG. Los productos de PCR fueron 55 y 61 pb de longitud, respectivamente. En Barcelona, los productos de amplificación de tamaño correcto se clonaron usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen), y varios clones de cada producto fueron secuenciados utilizando un secuenciador capilar ABI3730 (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. En Leipzig, los productos de cada PCR se agruparon y se ligaron con una secuencia de marcado específico para cada PCR como se describe | 25] y posteriormente secuenciados en una máquina de 454 FLX.

Controles de contaminación

Para determinar el grado de contaminación humana moderna en los extractos de ADN Neandertal nos amplificado y secuenciado, utilizando primers conservadas, una posición en el ADN mitocondrial (ADNmt) región codificante (transversión de diagnóstico 6267) de cada extracto de Neandertal donde se encontraron los neandertales a ser distinto de los humanos modernos [17], así como dos ADNmt región hipervariable I (HVR 1) fragmentos de diagnóstico entre las posiciones 16,135-16,] 69 y 16,182-16,223. Para garantizar que el número de copias de ADN nuclear es suficiente para amplificar ADN Neandertal nuclear y para vigilar la posible contaminación de ADN nuclear que, además, amplificado una posición de control en el cromosoma Y, que se describió anteriormente como ancestral en ambas muestras y define el clado más profundo el árbol del cromosoma Y humano (Y2 en]). Este clado se compone de todos los modernos humanos cromosomas Y haplogrupos fuera de África. Amplificaciones exitosas del fragmento de control cromosómica Y confirmaron que los dos especímenes etiquetados 1253 y 1351c provienen de dos individuos machos diferentes.

Resultados y discusión

En Barcelona, posición 26] en el exón 6 en la muestra 1253 se amplificó en cuatro PCRs independientes en paralelo con los controles de ADNmt (transversion de diagnóstico 6267 y ADNmt HVR] fragmentos) y el chromo nuclear y alguna posición. Los productos fueron clonados y al menos 10 clones secuenciados. Las secuencias de los cuatro productos para los 1253 muestra (n = 53) mostraron la supresión A261, que define los alelos S. Todas las secuencias de Y2 (n = 8) se encontró que eran ancestral (es decir, idéntica a la secuencia de chimpancé), mientras que 35 de 36 secuencias de ADNmt eran-Neandertal específico. De otra parte, amplificado y secuenciado posición 297 en el exón 6. Doce secuencias muestran una A en la posición 297, que es compatible con el haplotipo O más frecuente, el O01, pero no con el otro, el O02 | 5J. La posición 261 en el exón 6 también se amplificó en cuatro PCR independientes de la 1351c muestra junto con el fragmento Y2 y la posición ADNmt informativa 6267. Todas las secuencias de ABO (n = 55) eran idénticos a los encontrados en los 1.253 espécimen, mientras que todas las secuencias de Y2 (n = 4) fueron ancestral, y 35 de 36 secuencias de ADNmt eran específicos Neandertal (Tabla 1).

En Leipzig, la posición 261 y la posición 297 en el exón 6 en la muestra de 1253 se amplificaron en dos pasos independientes 2 Multiplex PCR junto con uno de los fragmentos de ADNmt informativos (posición 6267). Todas las secuencias para el fragmento de 261 en el primer PCR espectáculo A26] (n = 40), por 20 de las secuencias encontramos un adicional C> T sustitución en la posición 263, un cambio en esa posición no se encontró en ningún otro producto de PCR de Leipzig o Barce¬lona y es probable que se derivan de un error de codificación lesiones causadas por la desaminación de la citosina en la molécula antigua 126,27]. Para la segunda PCR de la muestra 1253, se encontraron 39 secuencias de ganar ’la A261 y 2] muestran una G en esa posición (Tabla 1). En la posición 297 una A se encontró en todos los clones de la primera PCR, mientras que en la segunda PCR mayoría de las secuencias (n = 49) mostrar una A y oth¬ers (n = 21) una G (Tabla 1). Para 1351c espécimen, sólo una PCR dio como resultado un producto que cubre la posición 261 donde algunas secuencias muestran la A261 (n = 43) y algunos no mostraron deleción (n = 41). Todas las secuencias (n = 50 y 41) en las dos PCR independientes para 1351c muestras mostraron una A en la posición 297.

Entre 82% y 85% se encontraron secuencias neandertales de los fragmentos de ADN mitocondrial informativos que fueron co-ampli¬fied lo largo de las posiciones ABO. A pesar de la transversión informativa en la posición 6267 en que los seres humanos tienen una A y una neandertales C, hay una segunda posición