CUANTIFICACION DE BKV ADN PCR

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- Operaciones Previas

- Limpieza de los equipos, superficies de trabajo y materiales

- La limpieza de los equipos, superficies de trabajo y materiales a ser usados durante el desarrollo del presente protocolo, se realizara en acuerdo a lo descrito en el procedimiento de Limpieza de Material P-LBM-001.

- La evidencia de estas limpiezas serán registradas en el R-LBM-001

- Verificación de las Pipetas

- Las micropipetas deben estar calibradas para dispensar correctamente el volumen requerido en el ensayo según el procedimiento de verificación y calibración interna del mismo IT-LBM-002 y al DE-LBM-002.

- Los datos de estas verificaciones serán registrados en el R-LBM-002 Verificación de pipetas.

- Preparación de los componentes del Kit para Cuantificación de BKV

- Mezcla maestra: Componente A: Mezclar bien con un vortex antes de usar y centrifugar brevemente para recoger el volumen completo

- Cebadores y sondas: Componente B: Centrifugar el vial durante 1 minuto a 11000 rpm. Abrir con cuidad la tapa del vial evitando la dispersión del polvo. Disolver de forma homogénea el componente B liofilizado con volumen de componente C indicado en la etiqueta del vial. Mantener la disolución en la parte superior de la mesa de trabajo durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente 15°C

- Control interno: IC: centrifugar el vial durante 1 minuto a 11000 rpm. Abrir con cuidado la tapa del vial evitando dispersión del polvo. Disolver de forma homogénea el IC liofilizado con el volumen del componente C indicado en la etiqueta del vial. Mantener la disolución al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Mezclar brevemente con un vortex.

- Curva estándar: STD: centrifugar el vial durante 1 minuto a 11000 rpm, abrir con cuidado la tapá evitando la dispersión del polvo. Disolver de forma homogénea el STD liofilizado con el volumen del componente C indicado en la etiqueta del vial. Mantener la disolución al menos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Mezclar con un vortex. Preparar 4 tubos libres de nucleasa para la preparación de la curva estándar. Establecer diluciones 1:10 para obtener los puntos de la curva:

STD

Calibrador 250000 copias/ul

Volumen del componte C

STD 1

25000 copias/ul

10 ul (STD) +90 ul de C

STD 2

2500 copias/ul

10 ul(STD1) +90 ul de C

STD 3

250 copias/ul

10 ul(STD2) +90 ul de C

STD 4

25 copias/ul

10 ul(STD3) +90 ul de C

- Preparación de la muestra.

Para la Recolección, identificación, manipulación, preservación y almacenamiento de las muestras, ver el procedimiento P-LBM-003

Las muestras son registradas en el R-LBM-003

- Extracción de ADN

- Para la extracción, identificación, preservación y almacenamiento del ADN de las muestras ver el procedimiento P-LBM-004.

- Amplificación Y Detección.

- Preparación de la mezcla de amplificación ( IC como control de amplificación)

- La mezcla de amplificación se prepara según los valores de la tabla teniendo en cuenta que el volumen total de mezcla es de 15 ul por reacción. Por tanto deberán hacerse los cálculos de acuerdo al número de reacciones.

Numero de reacciones

X1

X12

A

Mezcla Maestra

12.5 ul

150 ul

B

Cebadores/sondas

2 ul

24 ul

C

Control interno

0.5 ul

6 ul

VOL. TOTAL

15 ul

180 ul

- Procedimiento de amplificación

- Dispensar 15 ul de la mezcla de amplificación a cada uno de los tubos de reacción o pocillo de microplaca

- Añadir 10 ul del NTC, de la curva estándar y las muestras a los tubos de reacción.

- Cerrar bien los tubos de reacción

- Centrifugar brevemente los tubos de reacción a 2000 rpm

- No dejar los tubos de reacción a temperatura ambiente (RT) durante más de 30 minutos ni exponer a la luz(cubrir los tubos).

- Cargar los tubos en el soporte del bloque térmico del Termociclador Real-time

- Programar el instrumento Termociclador Real-Time según el instructivo I-LBM-010 configurando los siguientes datos del perfil térmico y también el esquema de la posición de las muestras (se puede configurar con tiempo anticipado) :

Posición

Muestras

1

NTC

2

ST 1

3

ST2

4

ST3

5

ST4