DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL METÓDO DE LOWRY

...

[pic 11]

[pic 12]

S

[pic 13]

%CV

µ

73.28

2.629

6.915

3.587

71.399 – 75.160

3. Efecto de Sustancias no Proteínicas en el método de Lowry

Se trabajaron con 5 sustancias no proteínicas para ver su efecto en el método de Lowry, interpolando las absorbancias en la ecuación de la recta de la curva de calibración, los resultados obtenidos son los siguientes.

[pic 14]

Tubo No.

Sustancia

[pic 15]

Cantidad de Proteína

[µg/mL]

Tipo de Interferencia Generada

1

TRIS 1M pH 7

0.106

37.3

Interferencia Negativa

2

Glicerol al 1%

0.158

62.0

Interferencia Negativa

3

Detergente comercial 1%

0.143

54.9

Interferencia Negativa

4

SDS al 1%

0.153

59.7

Interferencia Negativa

5

TCA al 5%

0.154

60.1

Interferencia Negativa

5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En esta práctica se llevó a cabo el método colorimétrico para cuantificar y determinar la cantidad de proteínas de una solución problema, para este caso se utilizó hemoglobina con una concentración de 0.25 mg/mL, se prepararon los tubos etiquetándolos y siguiendo el orden en el que se fue agregando cantidad de hemoglobina desde el primer tubo donde se agregó muy poca proteína hasta el tubo 5 donde se agregó una cantidad mayor de proteína.

- Curva de calibración de la hemoglobina por el método de Lowry

Para realizar la curva de calibración se fueron agregando a 5 tubos por duplicado, es decir 10 tubos las cantidades de proteína, reactivo A y reactivo C necesarios, la proteína utilizada en la práctica fue Hemoglobina con una concentración dicha anteriormente de 0.25 mg/mL, pero ya que para la práctica se pedían las concentraciones en µg/mL se realizó una pequeña conversión, la cual fue:

0.25 mg

1µg

1g

mL

1x g[pic 16]

1000mg

= 250µg/mL

Esta fue la cantidad de hemoglobina contenida en nuestra muestra, pero ya que la cantidad que agregamos con la pipeta, es decir la alícuota tomada de la muestra original fue en menor cantidad, se llevó a cabo la siguiente relación:

250 -----------------→ 1mL x= 25 [pic 17][pic 18]

x

Con esta relación se encontró la cantidad real de proteína que se fue agregando a cada uno de los tubos hasta el tubo donde se agregaron 0.5mL que corresponde a la concentración de 125 µg/mL.

Una vez conocido el valor de la concentración real de hemoglobina en cada uno de los tubos se desarrolló el método de Lowry, una vez que se agregó la hemoglobina se añadió el reactivo A que es el reactivo que le da alcalinidad al método, ya que la primera reacción que se lleva a cabo en el tubo es la reacción de Biuret que se lleva en un medio estrictamente alcalino, entonces con ayuda del reactivo A que contiene una solución de en NaOH que es un medio fuertemente alcalino y que ayuda a desarrollar la reacción colorida de Biuret, posteriormente se agregó el reactivo C que contiene una mezcla para formar el reactivo de Biuret, cabe señalar que este reactivo se preparó durante la práctica ya que es muy sensible a la luz y muy inestable después de mucho tiempo, así que se preparó agregando el reactivo B que contiene una solución de 1mL de CuS en citrato de sodio con 50 mL del reactivo alcalino A, una vez que se agregó el reactivo C se dejó desarrollar la reacción de Biuret por 10 minutos, esta reacción se lleva a cabo ya que los iones de cobre del reactivo de Biuret reaccionan formando un complejo en medio alcalino con los nitrógenos de los aminoácidos que forman a la proteína, al menos 2 enlaces peptídicos, formando un complejo cobre-proteína que da una coloración azul, este paso es muy importante ya que además de que el cobre su una con los aminoácidos de la proteína hace que dicha proteína pierda su estructura tridimensional compacta y los residuos de aminoácidos que tiene en este caso la hemoglobina.[pic 19][pic 20]

Dichos residuos de aminoácidos que quedan expuestos de la primera reacción servirán para la siguiente reacción, una vez que se desarrolló el color azul en todos los tubos con el reactivo de Biuret, para intensificar el color y poder leer al espectrofotómetro e utilizó un reactivo D que contiene el reactivo de Folin-Cicocalteu (ácido fosfomolibdotúngstico) que reacciona en un grado muy alto con aminoácidos que tengan en su grupo R residuos de Tirosina, triptófano y presenta también reacción con la Fenilalanina pero en menor proporción. Está reacción es una reducción del reactivo de Folin y en este caso el cobre actúa como un catalizador para