Desenredar la replicación del virus de la hepatitis C del genoma a la función

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HCV codifica dos proteasas notables

Los dos tercios carboxi-terminales de NS2 contienen la tríada catalítica de una cisteína proteasa. NS2 / 3 requiere estos residuos, así como la expresión aguas abajo del dominio NS3 serina proteasa, aunque la actividad proteasa NS3-4A es dispensable para el procesamiento NS2 / 3. El requisito de NS3 puede tener que ver con el plegamiento correcto, como NS2 / 3 de escisión se ve reforzada por Zn2 +, que tiene un papel estructural en la estabilización del pliegue NS3.

NS3 es una proteína multifuncional, con un dominio N-terminal serina proteasa y un C-terminal ARN helicasa / NTPasa dominio. Ambas actividades enzimáticas se han caracterizado bien, y las estructuras de alta resolución se han resuelto 14. El dominio de serina proteasa tiene un pliegue típico de tipo quimotripsina, colocando tres restos catalíticamente activos en la superficie interfacial entre dos dominios de barril (Figura 3a). Para el plegamiento completo y la actividad serina proteasa NS3 requiere la intercalación de una cadena presente en NS4A (refs 21-23). NS4A es una proteína pequeña (54-amino-ácido) que ancla NS3 a las membranas celulares a través de un péptido hidrófobo N-terminal 24. Plegamiento adecuado del dominio serina proteasa también requiere la coordinación de Zn2 + por tres residuos de cisteína distales del sitio activo. NS3 tiene una bolsa de unión a sustrato poco profunda para una serina proteasa, lo que ha desafiado los esfuerzos para obtener inhibidores específicos. Sin embargo, el descubrimiento de la inhibición del producto condujo al desarrollo de inhibidores potentes que bloquean la actividad de la serina proteasa NS3, el procesamiento de la proteína NS y la replicación del ARN del VHC. Para más detalles, véase el artículo que acompaña a De Francesco y Migliaccio (página 953).

Disección de la estructura y función de las proteínas NS del VHC

El término C de NS3 codifica una helicasa de ARN de DExH / D-box. Estas enzimas utilizan la energía de la hidrólisis del NTP para desenrollar el ARN bicatenario, y NS3 desenrolla los homoduplexes de ARN y ADN y los heterodúplex en un 3 A 5 dirección 25. El mecanismo de helicasa no es todavía completamente entendido, pero los análisis cinéticos recientes muestran que la helicasa NS3 se comporta como un motor de dos tiempos de trinquete 26 y parece funcionar como un dímero que incrementalmente desgarra 18 pares de bases tramos de ARN sustrato 27. Además, NS3 helicasa actividad puede ser regulada por las interacciones entre la serina proteasa y helicasa dominios de NS3 (refs 28, 29], lo que indica que estas dos actividades enzimáticas pueden ser de alguna manera coordinada durante la replicación. No se conoce la función de la helicasa del VHC, pero puede estar implicada en la iniciación de la síntesis de ARN en el ARN del genoma del VHC, que contiene estructura secundaria 3-terminal estable, en la disociación de las cadenas de ARN nacientes de su plantilla durante la síntesis de ARN o en el desplazamiento de las proteínas u otros factores que actúan en trans del genoma de ARN.

NS5A es una proteína fascinante. Muchas proteínas celulares interaccionan con NS5A, aunque su relevancia funcional es en gran parte claro 30-32. NS5A es fosforilado en múltiples residuos de serina por quinasas celulares y puede encontrarse en formas hipofosforiladas (56 kDa) e hiperfosforiladas (58 kDa). Los principales sitios de fosforilación se han determinado para unos pocos aislados de HCV 33,34, y se han identificado quinasas capaces de fosforilar NS5A. Estos incluyen AKT, p70S6K, MEK1, MKK6, proteína cinasa A - y

caseína quinasa II 35-38. Todavía no está claro qué quinasas están implicadas en la generación de los diferentes fosfoformas de NS5A, ni qué sitios de fosforilación son funcionalmente relevantes, y el papel del NS5A fosfo-

Imagen 405

Figura 1 | Ciclo de vida del VHC. Después de la entrada en la célula y sin recubrimiento, el genoma del VHC funciona en tres funciones principales: traducción, replicación y envasado en viriones nacientes.

La fiorelación sigue siendo un área de intenso interés.

Asociados NS5A con membranas a través de una hélice anfipática N-terminal 39 y contiene tres dominios estructurales distintos 40. Los análisis bioquímicos y estructurales revelaron que el dominio I (residuos 1-213) forma un dímero con una novela veces y coordina Zn 2+ a través de un motivo único 40,41. Esta arquitectura revela superficies externas conservadas que podrían interactuar con otras proteínas, así como un canal altamente básico que podría estar involucrado en la unión del ARN (Figura 3b). Además, se descubrió un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína 142 y 190, que es una modificación rara para las proteínas citosólicas y podría representar otra forma de regulación. Desafortunadamente, la información estructural aún no está disponible para los dominios II y III, que contienen determinantes que influyen en la eficacia de la replicación de ARN (véase más adelante) y fosforilación de NS5A. El dominio C-terminal no está bien conservada y parece bastante flexible 42,43.

El caballo de batalla de la maquinaria de replicación de ARN de HCV es NS5B, que codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). Primer-dependiente y de novo (sin imprimación) iniciación de la síntesis de ARN se han demostrado para esta proteína. Sobre la base de la estrategia de replicación de otros virus de ARN de cadena positiva, la replicación del ARN del VHC implica probablemente de novo iniciación por un complejo multiproteico (replicasa). NS5B tiene una estructura de la polimerasa 'mano derecha' típico, con los sitios catalíticos en la base del dominio de palma, rodeado de pulgar y el dedo dominios 14. Estos últimos dominios rodean completamente el sitio activo, creando un canal para la unión a una plantilla de ssRNA (Figura 3c). Además, una estructura-horquilla sobresale del pulgar hacia el sitio activo y es probable que participen en la posición correcta de la plantilla 44. La estructura general de NS5B es notablemente similar a la RdRP del bacteriófago 6 (ref. 45), y cocristalización de estas enzimas con sustratos modelo y trifosfatos de nucleósidos ha dado un modelo creíble para la iniciación de novo (revisado en ref. 46). NS5B también tiene un sitio de unión a GTP de baja afinidad, distal del sitio activo, que se cree que es un regulador alostérico de la interacción con los dedos pulgar 47. NS5B está atado a las membranas por un anclaje de péptido C-terminal 48 e interactúa con sí mismo para