Determinación de la estructura del complejo nuclear de poro con tridimensional Cryo Microscopía Electrónica

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componentes a la APN y sus subdominios (véase, por ejemplo, Refs. [1] y [25-30]). Sin embargo, todas estas técnicas clásicas EM sufren de limitaciones específicas. Los de sombreado y de tinción técnicas de metales pesados ​​pueden exagerar la estructuras observadas o ser más susceptible para los subdominios específicos que otros. Los procedimientos de envejecimiento im- bidimensionales limitan considerablemente la resolución alcanzable y por tanto restringen las cuestiones biológicas que pueden ser abordados. Tridimensionales (3D) de las técnicas de reconstrucción[31] y criomicroscopía electrónica mi- croscopy (cryoEM) de las muestras-cerca de nativos, congelados incrustado [32,33] que contienen NPC en un escenario en situ han demostrado mientras tanto su potencial para superar algunas de estas limitaciones.

Las reconstrucciones en 3D de la APN

Hinshaw et al. obtenido la primera reconstrucción en 3D de la NPC aplicando el método (RCT) aleatorio inclinación cónica para tiñeron negativamente Xenopus laevis (Xl) NE se extiende sobre rejillas EM[34], Que contienen un gran número de NPC por área de superficie (Higos. 1 y 2un). El método RCT se basa en la adquisición de micrografías electrónicas en diferentes ángulos de inclinación. Estas proyecciones se utilizan posteriormente para reconstruir un mapa 3D de la muestra[35]. Las primeras reconstrucciones cryoEM se obtuvieron de la Xl[36] y Saccharomyces cerevisiae (Sc) NPC [37] utilizando el método de RCT. En lo siguiente, se utilizó también tomografía criomicroscopía electrónica (cryoET) a 3D reconstruir la Xl NPC[38]. En contraste con la ECA, el enfoque gráfico tomo- es menos propenso a errores, ya que más

[pic 7]

Fig. 1. estructuras 3D de la APN que se resuelve utilizando EM. La línea de tiempo muestra estructuras representativas de la NPC dibujados a escala. El organismo modelo, el método utilizado y la resolución informado se indican cuando sea aplicable. Las imágenes han sido modificados a partir de las referencias citadas (extraídos: NPC se extrajeron de membranas usando heparina y / o detergente; Nuc: NPCs fueron incorporados en el NE de núcleos intactos; NE: NPCs fueron incorporados en los NE aislados; células enteras: Los datos fueron adquiridos en las células intactas).

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[pic 8]

Fig. 2. Visión general de la arquitectura NPC andamio y espécimen biológico utilizado para su determinación de la estructura [39].

(A) micrografía criomicroscopía electrónica de propagación Xl ovocito con alta densidad NPC [36]. (B) Tres rebanadas x-y secuenciales de 10 nm de espesor a través de un tomograma de un núcleo Dd. Las flechas indican la APN en la vista superior (izquierda) y vista lateral (derecha). Las puntas de flecha muestran los ribosomas que decoran la membrana nuclear externa. (C) Isosurface representación de la estructura de la NPC humano resuelto a 33 Å visto de frente (izquierda), cortado por la mitad e inclinó (derecha). Las membranas se muestran en marrón. Las dimensiones de CR, IR y NR se indican (adaptado de Ref.[7]).

exhaustivamente adquiere proyecciones en todo inclinaciones posibles y posteriormente combina subtomograms que contienen NPCs individuales promediando iterativo. Sin embargo, todos los estudios mencionados anteriormente muestrearon los NPC principalmente o exclusivamente en la vista superior, que orienta los ejes nucleocytoplasmic del paralelo NPC con el eje óptico de electrones (Figura 2un). Desde portamuestras en la transmisión de microscopios de electrones inclinar sólo hasta ~ 60 °, las reconstrucciones resultantes carecían de cobertura angular isotrópica. Si ninguna de las imágenes primarias contenía NPCs en vista lateral de manera que el interior fusionado (INM) y exterior (ONM) membranas nucleares son visibles, estas características también no ser resueltos en la reconstrucción resultante. Neverthe- menos, estas primeras reconstrucciones contenían características que se parecían a la 8 veces en rotación simetría de la NPC y capturaron las dimensiones generales en bruto.

El problema de la cobertura angular se abordó primero por un estudio que llevó a cabo los análisis de cryoET de núcleos aislados de la discoideum inferior eucariota Dictyostelium (Dd) [39]. El NE no se extendió en la parrilla de EM, pero encaja con su curvatura para permitir la obtención de imágenes de la APN en todas las orientaciones posibles, incluidas las vistas laterales en el que la membrana es visible (comparar

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Figura 2a y B). Después de la reconstrucción tomográfica de la NE, subtomograms que contienen NPCs individuales observados en diversas orientaciones diferentes se extraen in silico. Aunque cada subtomogram individuo tiene una cobertura angular no isotrópica debido a la restricción de inclinación del microscopio, la combinación de muchos cubre todos los ángulos de proyección necesarios. De esta manera, subtomo- gramos promedio nos permite obtener una reconstrucción 3D isótropo. Con una resolución global de 8-9 nm, la estructura Dd NPC por primera vez resuelto las membranas fusionadas y los tres anillos apilados. Desde entonces, numerosos estudios tomográficos han utilizado este llamado “procedimiento de falta de cuña ponderado sub tomografía promedio”[39,40] para analizar la estructura de los diversos complejos de proteínas, a menudo en el contexto de las membranas in situ (para revisión, véase, por ejemplo, Ref. [41]).

La plasticidad estructural intrínseca de la APN [3] tenido debe tenerse en cuenta con el fin de mejorar aún más la resolución. Subtomogram promediado se centró en las unidades asimétricas en vez de NPC enteras, es decir, los elementos individuales del conjunto de 8 veces de rotación, corregidas las desviaciones de la simetría ideales (el llamado promedio simetría-independiente). Esta

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estrategia facilitó la mejora de la resolución de la estructura de NPC a 58 Å [42]. La reconstrucción resultante reveló que la APN consistíade una estructura de anillo interior simétrico, mientras que los anillos oplasmic citoplasmáticos y nucle- distales muestran ciertas diferencias probablemente debido a diferentes subcomplexes se unen a ellos. El