Electroforesis en gel de poliacrilamida

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Discusión.

Se ensayaron 4 %T. 5.5, 7.5, 10 y 12.5. Se observa como respecto al aumento de concentración la nitidez y cantidad de bandas va aumentando, siendo 5.5 el gel donde menos bandas, más gruesas, menos definidas y a lo largo de la migración electroforética, tiene segmentos difuminados. Mientras que el gel de 12.5 tiene un mayor número de bandas mejor definidas y con pocos segmentos difuminados.

Así mismo, en todos los geles se ensayaron las mismas muestras y podemos ver que la distancia de migración electroforética disminuye conforme aumenta el %T y por tanto disminuye el tamaño de poro. Esto en consecuencia hace que en condiciones similares de voltaje y tiempo cada electroferograma tenga un avance distinto y esto de observa en la movilidad electroforética relativa siendo menor conforme se aumenta el %T y eso se ve en el comportamiento de la gráfica de Ferguson que tiene una pendiente negativa.

Por último, con la gráfica de Ferguson se obtienen 2 constantes importantes para las moléculas, estas son la carga eléctrica relativa de la proteína dada por la ordenada al origen y el tamaño molecular relativo de la proteína reportada por la pendiente. Gracias a esto, podemos afirmar en base a los resultados teóricos que la seroalbúmina posee mayor carga eléctrica relativa (2.3) que la caseína (2.1413) que a su vez es mayor que la de la conalbúmina (2.0268). Mientras que el tamaño molecular relativo es mayor en la conalbúmina (0.0664) que en la seroalbúmina (0.0555) y a su vez es mayor que en la caseína (0.0458), esto se coteja con la bibliografía que reporta 80 000 kDa para la conalbúmina, 52 000 kDa para la seroalbúmina y 23 600 kDa para la caseína bovina. Es concordante con lo obtenido experimentalmente.

Conclusiones.

- Se separaron adecuadamente las proteínas del suero, yogurt y clara de huevo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

- El %T es la concentración de monómeros adecuada para esta separación.

- La proteína de mayor carga eléctrica relativa es la seroalbúmina.

- La proteína de mayor tamaño molecular relativo es la conalbúmina.

Preguntas extra

- ¿En qué consiste una electroforesis SDS-PAGE?

SDS-PAGE es la electroforesis de proteínas más ampliamente usada. Su SDS-polyacrilamide gel electrophoresis. Fue descrito por Laemmli (Laemmli (1970), Nature, 277, p. 680). Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que rompe los puentes disulfuro, SDS que desnaturaliza y recubre a la proteína con cargas netas negativas), y se separan como cadenas polipeptídicas aisladas.

En general se emplean sistemas de dos tampones (discontínuos). Este sistema permite la separación de volúmenes relativamente grandes de muestra sin pérdida de resolución. La concentración se produce por isotacoforesis de la muestra en el primer gel ('stacking'). El efecto de estrechamiento de las bandas se basa en el hecho de que los iones glicinato, relativemente cargados negativamente (en el depósito de tampón superior) tienen una movilidad electroforética inferior que los complejos de proteínas-SDS. que a su vez tienen menor movilidad que los iones Cl- de los tampones de carga en el gel de apilamiento ('stacking'). Cuando se conecta la diferencia de potencial todas las especies han de migrar a la misma velocidad para mantener el circuito eléctrico. Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la misma velocidad que los iones Cl- si hay una región de 'field strenght'. 'Field strenght' es inversamente proporcional a la conductividad que es a su vez proporcional a la concentración, El resultado es que las tres especies de interés ajustan sus concentraciones de forma que [Cl-] > [proteína-SDS] > [glicinato]. Como sólo hay una pequeña concentración de proteína-SDS las tres se concentran en una banda muy delgada entre las fronteras de migración del Cl- y del glicinato. Cuando el glicinato alcanza el borde del gel de separación adquiere una mayor carga en el nuevo medio, con un pH superior, e incrementa su movilidad. A partir de ese momento la interfase entre el glicinato y el Cl- deja atrás a los complejos de proteína-SDS que se desplazarán a su propia velocidad. SDS es un detergente de acción desnaturalizante que se une a las cadenas polipeptídicas desnaturalizadas con una relación de 1.4 g de SDS por g de proteína, uniéndose aproximadamente una molécula de SDS por cada dos aminoácidos de la cadena. Esta unión masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la molécula de proteína y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las proteínas acomplejadas con SDS migren hacia el ánodo. La separación de los complejos SDS-proteína es proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas tienen la misma carga por unidad de masa. Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

- Electroforesis por isoenfoque.

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Una proteína tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que presenta un punto isoeléctrico (pI) que corresponde al valor de pH al cuál la molécula posee carga neta (z) igual a cero (zwitterion), y por lo tanto es inmóvil en un campo eléctrico.

Se establece un gradiente de pH en el gel de poliacrilamida, que puede tener forma de cilindro o lámina, realizando una electroforesis de una mezcla de polianfolitos (polímeros pequeños con múltiple carga). El gel suele tener urea, de concentración cercana a 6M, que a diferencia del SDS no posee carga y no puede afectar en forma directa la carga neta de las proteínas. Se coloca la muestra (mezcla de proteínas obtenida) en un buffer de baja fuerza iónica y con la aplicación de una diferencia de voltaje, las proteínas cargadas se desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a su punto isoeléctrico.[pic 19]

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