Electroforesis y PCR.

...

H2O = 12.7 microlitros x 7 = 88.9 microlitros[pic 4]

DNA= 2.0 microlitros 128.0 microlitros [pic 5]

20 microlitros

Las cuales se agregan en un tubo de PCR.

- Después tomamos 5 tubos y agregamos a uno 18 microlitros de master mix posteriormente le agregamos el DNA correspondiente:

- Los DNA utilizados fueron:

- Muestra 1

- FB1

- FA(1)/17

- 500

- Cepa

- Introducimos los tubos al termociclador ahí los dejamos por 2 horas y 15 minutos.

Electroforesis

- Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las muestras, los reactivos y el equipo.

- Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dos tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo negativo que serán conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis para ADN. Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.

- Añadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alícuotas, de acuerdo al número de muestras que se colocarán en los pocillos; mediante el uso de puntas de 20 µl proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos evitando la contaminación del pocillo contiguo.

- Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.

- Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado. El voltaje dependerá principalmente de las necesidades del operador y del tipo de ADN que es utilizado. Para el caso de productos de PCR, el voltaje puede estar comprendido entre 75 a 100 voltios. Es importante señalar que en la electroforesis de ADN el valor del voltaje debe ser constante, a diferencia del valor del amperaje que dependerá principalmente del valor del voltaje.

- Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con la desconexión de los electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de poliacrilamida.

- Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya realizando la separación de los vidrios que contienen el gel.

Resultados:

[pic 6][pic 7]

[pic 8]

La presencia [pic 9]de una banda fluorescente en el carril del gel corresponde al FB1 la cual permite verificar la presencia de material genético.

Conclusión:

Logramos observar que una de las muestras tenía presencia de material genético sim embargo pudieron ser varios los motivos los cuales las otras muestras, ya sea por el mal manejo del material o haber colocado mal está en los pocillos de del gel de agarosa o que realmente la muestra no contenía este material.

Referencias:

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap17.pdf

https://prezi.com/vpcmgmxhi-_n/laboratorio-pcr-y-electroforesis-en-gel-de-agarosa/

http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/41%20COMPROBACI%C3%93N%20COLONIAS%20TRANSFORMANTES%20PCR.pdf

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf

https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf

http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Electroforesis%2038.pdf

http://www.academia.edu/5188296/electroforesis