SEPARACION DE PROTEINAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

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Grafica 1. Grafica de Ferguson.

Tabla 3. Resultados de la ecuación de la recta

Muestra

Pendiente

(tamaño)

Ordenada al origen

(carga - )

Suero

-0.0296

2.164

Yogurt

-0.0086

1.911

Clara

-0.0101

1.731

- Concluya acerca del tamaño molecular relativo de las proteínas y sus cargas eléctricas al pH del regulador de trabajo (8.7 a 9)

El tamaño de las moléculas se obtuvo a partir de la gráfica de Ferguson ya que en esta a partir de la ecuación de la recta se puede obtener tanto el tamaño de la molécula como la carga negativa. La molécula de mayor tamaño en este caso es la clara después le sigue suero y finalmente el yogurt . Esto concuerda con el número de proteínas que se encuentran en cada muestra ya que en el se encuentra mayor cantidad de proteínas que en las otras dos muestras.

En cuanto al regulador este influye para poder determinar la carga negativa de nuestras proteínas, cabe señalar que la trisglicina fue la que dio carga a estas proteínas para que pudieran ser atraídas por los grupos OH del regulador al tener un pH alcalino.

- Diga cual %T recomienda para la separación de las proteínas de cada muestra, ¿Por qué?

Para hacer esta determinación se basa en el número de bandas que se formó en cada muestra a diferentes concentraciones de bis-acrilamida. Para todas las muestras fue al 7.5% de bisacrilamida al formarse 12, 14, 13 bandas ( suero, yogurth, clara)

- Escriba la reacción completa para la copolimerizacion de la acrilamida y la bisacrilamida por radicales libres, ¿Qué función tienen el TEMED y el per sulfato de amonio?

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El Sulfato se usó para dar pauta a la formación de iones y el TEMED funciona como catalizador.

- Mencione una aplicación de la electroforesis preparativa y una electroforesis analítica

La electroforesis es una técnica habitual en el laboratorio clínico. Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores.

5. Defina velocidad de migración y movilidad electroforética. Explique la diferencia.

La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.

V=qE/f

La movilidad electroforética (Me) es un caso particular de la velocidad de migración de un ión, cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga de la partícula.

La velocidad de migración electroforética depende de la densidad de carga de la molécula (relación carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre separación, por causa de la difusión por tiempo muy prolongado de la corrida electroforética.

- Defina el termino electroferograma.

Es el gel de poliacrilamida después de ser teñido, el cual muestra las bandas de separación de las proteínas de las diferentes muestras.

- Que otros agentes pueden utilizarse en lugar de la bis-acrilamida.

DISCUSIÓN

Albumina: 67 daltones

Caseina: 25000 daltones

Conalbumina: 66000 daltones

La electroforesis es un método de separación y cuantificación en base a la carga de las muestras a utilizar aplicando una diferencia de potencial para que la muestra corra, la electroforesis que se realizó en esta práctica fue una de zona ya que al dejar de aplicar la corriente las muestras no se vuelven a unir. También es una electroforesis discontinua ya que se utilizaron dos geles uno es el empacador y el otro es el separador.

En el gel empacador se utilizó para todas las concentraciones de las diferentes cámaras de electroforesis mientras que el gel separador fue diferente para cada cámara. La diferencia entre cada gel separador era la cantidad de bis-acrilamida para dar el tamaño del poro ya que a mayor cantidad de bis-acrilamida más pequeño es el tamaño del poro por lo tanto en el corrimiento de las cámaras en la de 5.5% debe ser mayor y en la de 12.5% mucho menor.

El corrimiento de una muestra depende del tamaño, la forma y la carga de esta también del voltaje aplicado