ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GELES DE POLIACRILAMINA

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En el campo de la investigación científica; Muchos científicos utilizan la a electroforesis en el área de genética forense como principal objetivo la detección de ADN ya que permite la estimación robusta de la cantidad de ADN y su calidad ya que la calidad es estimado por observación de la ausencia de rayas o fragmentos (Yábar C., 2003).

De igual manera utilizan los científicos la electroforesis para el cáncer humano, ya que se asocia con la forma de vida, antecedentes infecciosos, exposición a radiaciones, por lo que las investigaciones instrumentan acciones preventivas en la búsqueda [g]de tratamientos de origen natural como el uso de plantas. Es así que el objetivo de esta investigación es evaluar la actividad antigenotóxica utilizando el ensayo de Electroforesis Unicelular (ensayo cometa), método que evalúa el daño al ADN celular y es útil para estudios de genotoxicidad y antigenotoxicidad (Yábar C., 2003).

Para llevar a cabo este método analítico se tienen que tener en cuenta diferentes medidas de seguridad; entre las cuales se puede mencionar que para preparar y manipular los geles deben de utilizarse guantes ya que la acrilamida es neurotóxica altera al sistema nervioso (Bambeck SG., 1996).

OBJETIVO:

Determinar el peso molecular de la papaína comercial y de latex a partir por el método de electrforesis

Metodología:

Material Reactivos Equipos

∙1pipeta automática de 0.5-10

µl

∙1 pipeta automática de 20-

200µl

∙1 pipeta automática de1000µl

∙1 pipeta automática de 5ml

∙12 tubosEppendorff

∙1 piseta

∙1vaso de precipitado de 50ml

∙1 gradilla para tubos de ensaye

∙10 puntas de 10µl

∙10 puntas de 200µl

∙10 puntas de1000µl

∙4 puntas de 5ml

∙1 gradilla para tubos Eppendorff

∙4 tubos falcón de 15ml

∙1 gradilla flotante para tubos

Eppendorff

∙Regulador del

ánodo(fuera)

∙ Regulador del cátodo(Cámara de los geles)

∙Regulador del

Gel

∙Glicerol

∙TEMED

∙Persulfatode

Amonioal10%

∙ Solución para teñir el gel

∙ Solución desteñidora

∙ Regulador Fosfato de Potasio 50mM pH7.0a30°C

∙solución de

acrilamida- bisacrilamida

∙agua

∙Cámara de

electroforesis

Miniprotean(Biorad)

∙Fuente de poder

(Biorad)

∙Centrifuga

∙ parrilla de calentamiento

∙ Balanza analítica adventure Ohaus

Procedimientos efectuados en la práctica:

A) Preparación de las muestra latex de papaya:

1. se pesaron 10 mg de latex de papaya en un tubo eppendorf y se disolvieron en un volumen determinado de regulador de fosfato de sodio 50 mM.

2. se disolvieron las proteínas del latex en un regulado, se empleo un vortex

3. se centrifuo a 10,000 rpm/2min y 10 grados centígrados.

4. se tomaron 20 microlitros del sobrenadante para la determinación.

5. se le añadió 40 microlitros del regulador de muestra con mercaptoetanol (ME).

B) preparacion de la muestra papaína comercial CAT SIGMA P5306.

1. se pesaron 10mg de papaína comercial.

2. se disolvió 500 microlitros de regulador de fosfato de sodio.

3.se tomaron 20 microlitros de la solución anterior y posteriormente se añadieron 60 microlitros de regulador de muestra con (ME) hasta que se obtuvo una concentración de proteína 2-5 microgramos/microlitro.

C) Preparación del gel:

1. Se montaron la cámara de electroforesis

2. Se añadieron 0.65 gr de glicerol, 1.3 ml de acrilamida-bisacrilamida, 1,35 ml de agua, dodecil sulfato de sodio, 25 µl de persulfato de amonio, gelatina y 7.5 µl de TEMED

3. Se dejaron reposar por 10 minutos

4. Se preparó el concentrado del gel

5. Se añadieron 0.7 de acrilamida-bisacrilamida, 2 ml de agua, 1,35 del regulador del gel, 16 µl de persulfato de amonio y 7.5µl de TEMED

6. Se dejaron reposar

7. Se procedió a la electroforesis 40 mA por 2 h

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Resultados

[pic 3]

Gel de electroforesis(extracto de papaína)

Cálculosdelgelal13%

Formula: [pic