IDENTIFICACIÓN DE PROTEINAS ESPECÍFICAS POR WESTERN BLOT

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Un vez cargados los pocillos con las muestras conteniendo 10 ug de proteínas totales (Método de Bradford) y con el estándar de pesos moleculares, se introduce el sistema en el tanque de electroforesis, el cual se rellena con tampón de corrida. Por último, el sistema se conecta a una fuente de alimentación manteniéndose a 150 V durante 1 hora.

4.- Transferencia de las proteínas a membranas de Polyvinylidene difluoride (PVDF).

- Reactivos:

-Tampón de transferencia:

Tris HCl

48 mM

Glicina

39 mM

SDS

0.0375 %

Metano!

20%

pH

9.2

- Procedimiento:

La transferencia se efectúa utilizando el sistema húmedo de Bio-Rad y membrana de PVDF, siguiendo el protocolo recomendado por esta casa comercial.

Una vez terminada la electroforesis, el gel se introduce en tampón de transferencia para un enjuague y a continuación se le coloca en forma de emparedado (soporte-esponja-papel filtro-membrana PVDF-gel-papel filtroesponja-soporte) en el equipo de transferencia, en baño de hielo. Se conecta luego el sistema a una fuente de alimentación, efectuándose la transferencia y manteniéndose la intensidad de la corriente eléctrica a 350 mA durante 3 horas.

5.- Incubación con el anticuerpo (PARP): "Inmunoblotting" :

a) Reactivos:

- Tampón de lavado (TBS)

Tris-HCI 20 mM

CINa 137 mM pH 7.6

- Tampón de saturación de membrana:

Leche en polvo 5% en TBST (TBS y Tween 20 al 0.5 %)

- Anti-PARP (dilución 1:2000). Las diluciones se hacen en TBST.

b) Procedimiento:

En primer lugar la membrana de PVDF con las proteínas transferidas, se incuba toda la noche en tampón de saturación, para bloquear los espacios libres con caseína de la teche (también se puede usar albúmina). Luego se hacen tres lavados con TBS; a continuación se incuba la membrana durante 12 horas con el primer anticuerpo (en el presente caso con Anti- PARP). Luego se lava la membrana 3 veces con TBS y a continuación se incuba con un segundo anticuerpo Antj-lgG (de conejo) marcado o conjugado con peroxidasa y diluido.1:5000 en TEST. Finalmente se lava la membrana tres veces con TBS.

6.- Revelado o identificación de la proteína a estudiar.

a) Reactivos:

- Tampón ECL

Tris-HC1 10mM, pH: 8.5

- Luminol 4 mg de Luminol disueltos en 25 ul de NaOH IN y completados hasta 5 ml con tampón ECL.

- -Yodofenol

1 mg de 4-yodofenol disueltos en 5 ml de tampón ECL.

c) Procedimiento:

Tras la mezcla de los reactivos Luminol y yodofenol en volúmenes iguales, se añade 5ul de H2O2 concentrado y se incuba la membrana durante 1 minuto. A continuación, en cuarto oscuro, la membrana se coloca en un casete, en contacto con una película radiográfica (Hyperfilm MP de Amersham) durante 2 ó 3 minutos. Por último, la película se revela de una forma manual, modificando los tiempos de exposición según las circunstancias.

RESULTADOS:

[pic 2][pic 3]

Figura N° 1.- Degradación de la PARP en macrófagos de rata tratados con Uncaria tomentosa.

Las células fueron incubadas con "uña de gato" al 20 % durante los tiempos indicados. Los "western blot" fueron realizados como se indica en la sección de Métodos. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

INTERROGANTES:

- ¿Qué función cumple el SDS?

- ¿Qué ocurre, si a la membrana de PVDF no se la trata con leche en polvo (caseína)?

- Interprete los resultados mostrados en la figura

- ¿Por qué aparecen otras bandas en el revelado de inmunoblotting?

- ¿Qué significa la banda de 85 Kd?

- ¿Por qué no aparece la banda de 31 Kd?

- ¿Qué es un anticuerpo conjugado?

- ¿De qué otra forma se puede revelar para identificar a la proteína en estudio?