Informe de laboratorio LABORATORIO DE BIOQUIMICA II

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Los cuerpos cetónicos son utilizados por los tejidos extrahepáticos por medio de la conversión del β-hidroxibutirato a acetoacetato y de acetoacetato a acetoacetil-CoA. El primer paso consiste en la reversión del β-hidroxibutirato deshidrogenasa (ver figura # 3), y el segundo se refiere a la acción (abajo) de la 3-oxoácido-CoA transferasa (SCOT), también llamada 3-cetoacetil-CoA transferasa. La ultima enzima está presente en todos los tejidos excepto en el hígado. Importantemente, su ausencia permite que el hígado produzca cuerpos cetónicos pero que no los utilice. Esto asegura que los tejidos extrahepáticos tengan acceso a los cuerpos cetónicos como fuente de energía durante el ayuno y el hambre prolongados.

Figura # 3. Reacción de acetil-CoA

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La primera prueba de evaluación de cuerpos cetónicos, fue el test de Griebel y Weiss, característica de la acetona, la cual se basa en la formación de la p-nitrofenilhidrazona de la acetona (figura 4), liberada como producto de la destilación a causa de la baja temperatura en la que se encuentra la orina, en el laboratorio esta prueba fue positiva debido a la formación de cristales en forma de agujas, lo cual es respuesta positiva a dicha prueba.

Figura # 4. Reacción prueba de Griebel y Weiss.

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Foto # 1. Prueba de Griebel y Weiss

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En ayunas – Después del desayuno

Figura # 5. Prueba de Legal.

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El ácido acetoacetico y la acetona reaccionan con el nitro prusiato de sodio al 10% en medio básico produciendo un complejo colorante violeta siendo la intensidad del color proporcional a la concentración de los analitos, el límite de detección para el ácido acetoacetico es de 5 a 10 mg, y para la acetona es de 40 a 70 mg por dL de orina, [6]. Sin embargo el resultado es positivo ya que el color que se observa en la muestra de orina en ayuno son de café oscuro y no el color que debería presentarse, solo la muestra patrón si dio el color violeta que se esperaba (ver Foto # 2), una explicación que se puede dar a estos resultados es que ya que los cuerpos cetónicos son una fuente de energía para el músculo y el sistema nervioso central y se filtra libremente en el glomérulo (unidad anatómica funcional del riñón), pero la acetona se volatiliza por el pulmón, y es por esto por lo que aparece en cantidades menores en la orina.

Foto # 2. Prueba de Legal

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a). b).

Muestras de izquierda a derecha: muestra orina. Muestra patrón, blanco.

a). Con adición 0,5 mL nitroprusiato y 10 gotas NaOH 10%.

b). con adición de 1 mL ácido acético.

Prueba es la de Gerhardt :

La cual caracteriza la acetona. Con el fin de tener resultados confiables se realizó un blanco y un patrón (acetona), esta prueba consiste en la formación de un precipitado de color amarillo, debido a que reacciona la acetona con la solución de Iodo/Ioduro en medio básico. Cuando se llevó a cabo la prueba en la muestra después del desayuno se observó un leve precipitado de color amarillo, mientras que la muestra en ayuno el color era más intenso una razón es que en la orina fresca el ácido diacetico o acetoacetato es 3 a 4 veces mayor que la de la acetona, pero si dejamos la orina en reposo la acetona puede aumentar por la descomposición que sufre el acetoacetato rapidez, [3] (ver foto # 3), la acetona de un color amarillo con menos intensidad y el agua no da coloración; la reacción que transcurre en esta prueba se presenta en la figura 6.

Figura # 6. Reacción prueba de Gerhardt.

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Foto # 3. Prueba de Gerhardt.

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En ayuno precipitado amarillo después del desayuno

Prueba de Lieben:

Se realizó en esta práctica con el fin de determinar la presencia de cuerpos cetónicos en la muestra de orina. El resultado de la caracterización demuestra la presencia de acetona en muy baja concentración en la orina, debido a que se presentó una coloración roja leve tanto para la muestra en ayunas como para la muestra después del desayuno, sin embargo para el patrón (acetona) fue positiva con un color más intenso, esto se debe a que el hierro reacciona con las cetona y con la muestras, donde se forma una solución de coloración roja la cual desaparece al colocar las muestras en calentamiento por unos minutos, pero no desaparece con la muestra de acetona como patrón.

Foto # 4. Prueba de lieben

[pic 15]muestras sin calentamiento muestras en calentamiento durante unos minutos [pic 16]

Prueba de Arreguine:

Esta prueba es característica para el acetoacetato, dio positiva para las muestras en ayuno y después del desayuno, por mostrar una fluorescencia azul en la lámpara de UV, el patrón mostró la reacción positiva, la prueba dio negativa con el blanco tal como se esperaba por la ausencia del acetoacetato. La reacción que se lleva a cabo en la muestra, es la formación de un compuesto de condensación del acetoacetato presente en el medio con el resorcinol al 20% formando un cromóforo ya que este reactivo se usa como absorbente en UV y considerando a su vez un ambiente fuertemente deshidratante, [3]. La reacción de la prueba de Arreguine se presenta en la figura 7.

Figura 7. Reacción prueba de Arreguine.

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Foto # 5. Prueba de Arreguine.

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Muestras en lampare UV ----------- Muestras (Der después del desayuno),

(Izq en ayuno)

- Conclusiones

- Las pruebas que se realizaron cualitativamente fueron