Integración de las herramientas de ingeniería metabólica y de proteínas para la biosíntesis química de próxima generación

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Las enzimas impulsan el flujo a través de las vías metabólicas. Al final, la productividad de una vía está dictada por las características cinéticas de las enzimas implicadas. Las propiedades enzimáticas que influyen en el flujo antes mencionadas (solubilidad, localización, dependencia del cofactor, inhibición del producto, especificidad del sustrato / producto, velocidad catalítica y estabilidad) son algunas de las características bioquímicas de las proteínas que pueden ser manipuladas para cualquier enzima en particular y pueden ser tratadas Utilizando técnicas de ingeniería de proteínas. Algunas de estas propiedades también están influenciadas por el equilibrio metabólico y los niveles de otros metabolitos, cofactores o inhibidores. El grado en que cada uno de estos factores impide la ingeniería metabólica directa de una vía heteróloga depende de las características de la enzima nativa.

Recuadro 1.

Meta-análisis de cinética natural de la enzima. Los biólogos siempre han tenido una apreciación de la importancia de la cinética enzimática en el metabolismo celular de diferentes organismos. Pero hasta hace poco tiempo, ninguno se había esforzado en perseguir un meta-análisis exhaustivo de las numerosas enzimas naturales cuya cinética se había caracterizado en estudios independientes. Bar-Even et al. Estudiaron el kcat y kcat / KM de varios miles de enzimas naturales y descubrieron que las tasas medianas eran ~10 s-1 y ~105 s-1 M-1, respectivamente. Estas cinéticas están lejos de ser limitadas por la difusión (> 108 s-1 M-1) e indicativas de presiones selectivas evolutivas insuficientes para obtener eficiencias catalíticas máximas. La principal implicación para el diseño de cepas microbianas biosintéticas es que incluso las vías que producen metabolitos primarios tienen espacio para los esfuerzos de ingeniería de proteínas para facilitar las mejoras del proceso. Cuando se comparó la cinética relativa de diferentes clases de enzimas, se encontró que las tasas medias para las enzimas del metabolismo secundario son ~ 30 veces menores que las del metabolismo primario del catabolismo de los carbohidratos y la producción de energía (Figura 2a).

Las diferencias entre las enzimas del metabolismo primario y secundario se derivan de las presiones selectivas conflictivas y los requisitos de diversidad de las enzimas secundarias y metabolitos. Debido a que la actividad biológica es un rasgo raro en los compuestos químicos, la búsqueda de la naturaleza por las interacciones proteína-ligando exige la diversidad de los metabolitos secundarios generados por la promiscuidad enzimática (en sustrato y producto). Por lo tanto, los ingenieros metabólicos que buscan construir cepas que producen metabolitos secundarios se enfrentan a un requisito más que una oportunidad de aplicar técnicas de ingeniería de proteínas para superar la inef fi ciencia catalítica de las enzimas del metabolismo secundario relevantes como se describe por Bar- Even et al. Así como la promiscuidad de sustrato / producto seleccionada para la naturaleza.

CONSTRUCCIONES SOBRE LA BIOSÍNTESIS METABOLITA SECUNDARIA

Los esfuerzos de investigación en la ingeniería metabólica a menudo emulan los procesos biosintéticos utilizados en la naturaleza. La evolución ha formado múltiples rutas para producir bioquímicos individuales a partir de varios puntos de partida (es decir, glucosa, glicerol, etanol, xilosa, dióxido de carbono). Algunas vías metabólicas están altamente dirigidas (biosíntesis de fosfolípidos o triptófanos), mientras que otras son fenomenalmente diversas (biosíntesis de terpenoides o flavonoides). En estas vías diversas, la biosíntesis ha evolucionado para utilizar acoplamiento secuencial de bloques de construcción más pequeños seguidos de reacciones de ciclación para crear marcos de hidrocarburos. Estos esqueletos químicos pueden hidroxilarse, oxidarse o reducirse para aumentar la diversidad o permitir una funcionalización adicional tal como acetilación, glicosilación y amidación (Figura 3a). El marco y la diversidad funcionalizada pueden surgir de la presencia de múltiples enzimas que actúan sobre el mismo sustrato o un sitio activo promiscuo que puede actuar sobre múltiples sustratos. Las vías diversas también pueden mostrar características similares a la red, con enzimas idénticas que actúan en secuencias alternativas para producir productos similares (Figura 3b).

Con el tiempo, la presión evolutiva selectiva ha inducido una evolución más estricta de las enzimas del metabolismo primario resultando en una especificidad y actividad mejoradas. Como resultado, la ingeniería de cepas microbianas que sobreproducen metabolitos primarios conduce a menos desafíos de actividad / especificidad y puede modularse eficazmente cambiando la concentración enzimática. Por el contrario, las vías de biosíntesis de los metabolitos secundarios muestran más promiscuidad enzimática, que está bioquímicamente relacionada con una actividad catalítica reducida. Debido a que la actividad biológica es una característica generalmente poco común en el paisaje químico, la naturaleza ha desarrollado enzimas para la biosíntesis de metabolitos secundarios con mayor sustrato y diversidad de productos, en contraste con sus contrapartes del metabolismo primario. Esto hace que la ingeniería de vías metabólicas secundarias sea una tarea difícil. Independientemente de si el factor limitante es la promiscuidad perjudicial o la actividad insuficiente, hay espacio en estas vías para la optimización sustancial de las enzimas.31 Discutiremos esto con dos ejemplos: vías metabólicas terpenoides y flavonoides.

La vía terpenoide es una de las rutas de metabolismo secundario más diversas de la naturaleza con más de 55.000 miembros (Figura 3a). Se han identificado muchos terpenoides con una amplia gama de aplicaciones útiles. 40 Las enzimas terpeno sintasa y ciclasa estructural y funcionalmente similares han evolucionado a través de la duplicación génica para convertir las moléculas de la cadena principal del pirofosfato alílico (PP) de la vía, geranil-PP, farnesil-PP y Geranilgeranil-PP, en compuestos desfosforilados ya menudo ciclizados o ramificados, denominados monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos, respectivamente. La química de defecto / defecto de la naturaleza en la ciclación terpenoide (sustratos alílicos con estados de transición de carbo-cationes altamente inestables) juega un papel importante en la creación de la diversidad química. A nivel enzimático, muchas sintasas terpenoides tienen sitios catalíticos evolucionados que coordinan estados de transición ligeramente encuadernados y exhiben una drástica