Manual de bioquimica metabolica Universidad de Sonora

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2 vasos de precipitado de 250ml.

4 erlenmeyer de 1000 ml.

4 embudos de vidrio

16 tubos de centrifuga de 13x100

Tubo de ensaye grande con tapón agujerado.

Tubo de vidrio 25 cm.

Gradilla

Hielo

Centrífuga

Papel filtro

Tercera parte:

Cuba para hielo

6 tubos de ensaye de 13x100

2 vasos de precipitado de 100ml

2 vasos de precipitado de 50 ml

2 matraces de 1000 ml

Embudo

Gradilla

Hielo

PROCEDIMIENTO

PRIMERA PARTE

A.- ANESTESIA DEL CONEJO

- Inyecte el conejo por vía intraperitoneal con 1.0 ml de sulfato de magnesio pentahidratado al 51% por kilo del conejo, y déjelo libre.

- Si a los 10 minutos el conejo no se ha anestesiado, inyéctele nuevamente sulfato de magnesio, esta vez 0.5 ml. por kilo de peso, y así sucesivamente, cada 10 minutos hasta que el animal no de reflejo ocular (puede llevarse hasta media hora).

B.- OBTENCION DEL MÚSCULO

- Decapite al conejo (córtele la yugular, y deje que se desangre lo mejor posible.

- Inmediatamente, y trabajando con la mayor rapidez, proceda a despellejarlo. (entre varios se puede organizar el trabajo y terminar el trabajo más rápido). Para esto, lo mejor es con tijeras y navaja filosa hacer un corte circular en la piel de cada pata trasera, y continuar el corte por la parte inferior de las patas. Se separa la piel tirando de ella con fuerza hacia la cabeza.

- Quite todo lo más que pueda de músculo de las patas traseras y del lomo, póngalo en un vaso de precipitado de 500 ml. pesado de antemano y sumergido con tiempo en el hielo. Pese el músculo total que obtuvo. Tiene que obtener un mínimo de 500 gramos.

- Corte el músculo con tijeras o navaja. En fragmentos muy pequeños, procurando que el músculo este lo menos tiempo posible fuera del hielo.

C.- EXTRACCIÓN DEL ATP

- Triture el músculo en la licuadora, cuidando que el vaso de la licuadora haya estado en el refrigerador unos 15 minutos. Se debe triturar en pequeñas porciones, cada vez con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10 % frío. no introduzca los 500 gramos a la vez. Hágalo en porciones de 50 a 100 gramos cada vez, con 50 o 100 ml. de tricloroacético. Con un minuto de trituración, u homogenización para cada porción, es suficiente. Filtre el extracto a través de un lienzo o pañuelo. Si es necesario exprima manualmente para extraer el liquido, pero use guantes para que el tricloroacético no toque la piel, pues la quema.

- Trate el residuo nuevamente con un volumen igual de tricloroacetico al 5% en la licuadora, de la misma manera que se hizo antes. Filtre y combine los filtrados.

- Filtre los extractos combinados a través de buchner con vacío. Se debe obtener un filtrado claro. Vuelva a filtrar si es necesario. Se puede filtrar con embudo de vidrio, se puede obtener mejor filtrado.

- Añada unas 5 gotas de azul de bromotimol y titule hasta pH 6.8 (color verde), añadiendo hidróxido de sodio al 40 % (se requieren unos 40 ml. de NaOH por cada litro de extracto).

D.- PRIMERA PRECIPITACION COMO SAL DE BARIO

- Añada acetato de bario 2.0 M al filtrado, 3.0 ml. de acetato de bario por cada 100 gramos de músculo.

- Agite y deje reposar la mezcla toda la noche, o hasta la siguiente sesión de laboratorio. (poner en el refrigerador)

SEGUNDA PARTE

- Decante lo más que pueda del líquido y luego centrifugue por 3 a 5 min. Descarte el sobrenadante.

- Disuelva el precipitado en ácido nítrico 0.2 N (40 ml. de Nítrico por cada 100 gramos de músculo original). Si hay residuo insoluble, filtre para descartarlo.

- Añada el reactivo de Lohmann (1.0 ml. de reactivo por cada 100 gr. de músculo original), para precipitar el ATP en forma de sal de mercurio.

- Enfríe en baño de hielo por 15 min.

- Decante lo más posible y centrifugue el resto para aislar el precipitado. Descarte el sobrenadante.

- Resuspenda el precipitado en 30 ml. de agua destilada.

- Sature la solución con H2S para deshacer la sal de mercurio del ATP (Esto se hace con clorhídrico más pirita, en un tubo de ensaye grande, conectado por tubo de vidrio delgado a la solución).

- Agite bien para descomponer toda la sal mercúrica de ATP.

- Centrifugue y conserve EL SOBRENADANTE. Descarte el precipitado. Si es necesario filtre para obtener un filtrado claro a partir del sobrenadante.

- Lave el precipitado de HgS, sobre el mismo embudo de filtración con unos 10 ml. de Nítrico 0.2 N. Hágalo tres veces. Combine estos filtrados con el sobrenadante obtenido en el número anterior.

- Deje que los filtrados combinados se aireen hasta que no haya H2S. Si es posible pase aire a través de la solución durante una media hora.

- Neutralice la solución hasta pH 6.8 como antes.

- Añada Acetato de bario 2.0 M (3 ml por cada 100gramos de músculo original), o sí prefiere hágalo gota a gota hasta que al añadir una gota más ya no se forme precipitado.

- Guarde en el refrigerador la precipitación toda la noche o hasta la siguiente sesión de laboratorio.

TERCERA PARTE

- Decante lo más posible y centrifugue por último para obtener el precipitado.

- Disuelva el precipitado en 3 ml. de