Separación de orgánulos celulares

...

Fig. 2 Homogenización del tejido[pic 9]

Una vez homogenizado el tejido animal y viendo que se obtuvo una mezcla viscosa se le agregaron 15 ml de solución de lisis II.

Una vez agregada esta solución se filtró la solución con gasas en un tubo para centrifuga previamente frio.

Fig. 3 Vertido de la solución de lisis II[pic 10]

[pic 11]

El tejido se centrifugo a 2500rpm durante 10 min esto para separar los tejidos que se desean obtener.

Una vez saliendo de centrifugarse se decanta el sobrenadante de esto para poder observar la pastilla.

Fig. 4 Centrifugación del tejido ya con solución

Fig. 5 Tubo después de

Salir de la centrifugadora[pic 12]

Se re suspendió el pellet con 1ml de solución de lisis II y posteriormente se pasaron a unos micro tubos, para poderlos centrifugarlos a 9300 rpm durante 10 min, esto con el fin de obtener en el pellet los orgánulos ya aislados,

Fig. 6 Re suspensión del pellet

[pic 13]

El precipitado que se extraía eran las mitocondrias y estas se diluyeron en 5ml de solución hipotónica.

Una vez hecho esto se le agrego solución isotónica y 3 gotas de glicerol para poderlo refrigerar

Fig. 7 Extracción de las mitocondrias

Discusión de resultados

Cada uno de los orgánulos celulares es obtenido mediante distintas revoluciones ya que cada uno de ellos es muy distinto en cuanto a su densidad por lo tanto dependiendo a la fuerza aplicada el resultado será distinto, este método puede ser de gran utilidad para poder observar a detalle el orgánulo que se desea observar como también para su estudio y la obtención de material genético en caso de ser necesario.

El desarrollo de técnicas de fraccionamiento celular es un medio para lograr el análisis de la composición y propiedades de elementos celulares purificados. El fraccionamiento subcelular es esencial para el desarrollo de ensayos “libres de células”. Estos ensayos han provisto de nuevas e importantes herramientas para entender los mecanismos moleculares de las diversas funciones celulares. La microscopía electrónica y con-focal determinan la disposición de los orgánulos y de los grandes agregados macromoleculares en las células y tejidos; sin embargo, muchos estudios bioquímicos e inmunológicos requieren del aislamiento de orgánulos subcelulares.

Aislamiento de organelos en macrófagos humanos infectados con Mycobacterium tuberculosis

Karen Bobadilla,* Fernando Hernández-Sánchez,* Yolanda González-Hernández,*

Martha Torres-Rojas*

Departamento de Investigación en Microbiología. Unidad de Investigación. Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias

Ismael Cosío Villegas.*

Trabajo recibido; 30-IX-2010; aceptado: 10-II-2011

Neumol Cir Torax

Vol. 69 - Núm. 3:151-156

Julio-septiembre 2010

1.- El color verde que se presentó en la muestra, se entendió que hubo una buena precipitación de cloroplastos y en gran cantidad, ya que la centrifugación diferencial hace que se sedimenten las sustancias de acuerdo al peso de los organelos, también se podría decir que no solamente presentaba cloroplastos allí, si no, también fragmentos celulares. Para consultar el grado de pureza el contenido debe evaluarse mediante un análisis microscópico (Lodish et al. 2006).

La correcta diferenciación también se dio gracias a una homogenización correcta de Spinasia olerancea (espinaca) ya que fue un tejido fácil de tratar, la adición extra (15 mL) de la solución de lisis I en el último paso para almacenar, para tener un p H estable para el tejido y el rompimiento que las partes restantes de la membrana celular.

2.- La difícil suspensión probablemente se debió a la centrifugación que fue a mayor cantidad de gravedades que la muestra vegetal, se podría decir entonces que las mitocondrias son más ligeros que los cloroplastos, porque necesitarán mayor rpm (Jiménez- García y Merchant- Larios, 2003). Y a que se trabajó en frío, es muy probable que las mitocondrias se conserven en un buen estado para su posterior estudio (Pérez-Mertínez y Shingú- Vázquez, 2005). Aunque no se agregó solución de lisis para almacenar, es posible que sea necesaria para suspender después de almacenar pero en cantidad moderada para no dañar las mitocondrias, aunque al final se prefirió no hacerlo (Sanz-Magraré, 2012).

Conclusión

Como requisito indispensable para un buen fraccionamiento celular, con ayuda de la solución de lisis (I y II), la baja temperatura para macerar los tejidos y una concreta centrifugación. Entre las fases de las muestras de tejido, las mitocondrias son más ligeras que los cloroplastos; y su pureza en cualquier muestra no puede ser del 100%, sin embargo, puede ser comprobado mediante una evaluación a microscopio. Independientemente de la eficiencia resultante, se logró hacer lisis celular y separar los orgánulos deseados.

Al homogenizar el tejido animal se tuvo un problema ya que no había nitrógeno líquido, sin embargo se utilizó otra técnica la cual era poner el mortero en hielos para tenerlo frio y así poder homogenizar el corazón de pollo para obtener la mezcla viscosa de este y añadirle la solución de lisis II.

Debido a este problema al filtrase esta solución por las gasas se tuvo una coloración más clara que el de los demás equipos, esto se puede suponer que debido al nitrógeno líquido el tejido se homogenizaba aún mejor, por lo cual se mezclaba mejor con la solución.

Pero cabe destacar que esta técnica sirvió por que obtuvimos una pastilla de buen tamaño lo cual quiere decir que se pudieron aislar los orgánulos como la membranas y algunos núcleos que contenía el corazón, cabe mencionar que estas técnica aplicadas en esta práctica