Tema de Obtención y análisis de fracciones celulares

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3. Coloque el sobrenadante del proceso anterior a 2 ependorf nuevos y márquelos con la palabra mitocondrias. Centrifugar a 10000 rpm durante 8 minutos. (El pellet que ha quedado se denomina fracción mitocondrial, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 ul de NaCl al 9 %).

4. Ahora observaremos la fracción nuclear. Para ello colocamos 10 μl del resuspendido del tubo marcado como núcleo, en una lámina porta objeto y le adicionamos una gota de Azul de metileno y cubrir con una lámina cubreobjeto. Hacer las observaciones en el microscopio de campo claro y realice sus esquemas.

5. Observación de mitocondrias. Tomar el tubo marcado como mitocondrias y en un ependorf de 0,5 ml adicione 5 μl del colorante verde de Janus. Realice un frotis y observe al microscopio de campo claro. Esquematizar a 400X

- RESULTADOS:

- Al realizar el primer centrifugado, en el cual sometimos la muestra a una centrifugadora a 4000 rpm por 3 minutos, obtuvimos dos fracciones; un sobrenadante y un pellet. Separamos ambas partes, al pellet que es donde se encuentra el núcleo y el sobrenadante que es donde se encuentran las organelas.

- En el segundo centrifugado, utilizamos el sobrenadante que quedó anteriormente para obtener la fracción mitocondrial. Centrifugamos a 10000 rpm por 8 minutos. Al final de este proceso se volvió a tener un sobrenadante y un pellet al cual el sobrenadante fue desechado.

- Se pudo observar en el microscopio que la muestra del spendor del núcleo se tiñó de color azul y la muestra del spendor de mitocondria se tiño de un azulado verdoso.

- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

- Cuando se junta una gota del spendor del núcleo con azul de metileno, este reconoce a los ácidos que se encuentra en el núcleo, específicamente en los grupos fosfatos, haciendo que se tiña de color azul. Esto corrobora lo siguiente: “El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus núcleos”.([2])

- Al mezclar una gota del spendor de mitocondria con una gota de verde janus este se tiñe de color azulado verdoso porque este tinte está en su forma oxidada, el verde Janus se mantiene en ese estado oxidado por el sistema de oxidasa citocromo de la mitocondria. Esto es confirmado por: “En el citoplasma, el Verde Jano está en forma reducida, incoloro, pero en el interior de la mitocondria es oxidado por las enzimas locales, adquiere el color verde azulado, típico de la coloración vital”.([3])

- Se pudieron observar las estructuras de la célula ya que el NaCl al 9% permitió que la muestra se conserve y no sufra ningún daño debido a su compatiblidad. Comprobando la teoría que menciona : “ El suero fisiológico es una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% de sustancias compatibles con los organismos vivos debido a sus características definidas de osmoticidad, pH y fuerza iónica”.([4])

- CONCLUSIONES:

- Se pudo identificar las estructuras muy bien definidas con diferentes colorantes.

- Se consiguió conocer técnicas de fraccionamiento para poder realizar el estudio de organelas.

- Cada colorante reacciona de una manera diferente con las distintas estructuras celulares.

- REFERENCIAS:

(1)Fraccionamiento celular. 8th ed. México: Mac Graw-Hill Interamericana Editores; 1998.[5]

(2)Tinción [Internet]. Es.Wikipedia.org.2016 [citado 11 Mayo 2016]. Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n#Azul_de_metileno

(3) Kotsias Basilio A.. Las mitocondrias y el verde Jano. Medicina (B. Aires) [Internet]. 2005 Mar [citado 2016 Mayo 11] ; 65( 1 ): 75-79. Disponible en: .

(4) Crocco M, Fratnz N, Bos-Mikich A. Substrates and supplements for hESCs: a critical review. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2013;30(3):315-323.

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