Experiencia 3: Separación de aminoácidos por cromatografía en papel

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Metodología

[pic 19]

- Se prepararon 60mL de una solución de butanol-ácido acético-agua (ilustración 1) en una proporción (12:3:5) respectivamente:[pic 20]

Butanol36mL [pic 21]

Ácido acético 9mL[pic 22]

Agua15mL[pic 23]

- Dicha solución se colocó en un frasco de vidrio. Asimismo se prepararon soluciones de fenilalanina y ácido aspártico.

- Sobre una cartulina se cortó una tira de 4x10cm del papel filtro y en uno de los extremos se trazó una línea a 1 cm del borde, sobre la cual se hicieron 4 puntos a una distancia entre si de 0.5 cm aproximadamente.[pic 24]

- En el primer punto marcado se colocó una alícuota de la solución de fenilalanina (ilustración 2), y se secó (ilustración 3)con ayuda de la secadora; se realizaron 5 aplicaciones secando en cada una de ellas. Con las demás muestras (ácido aspártico, refresco de dieta y refresco normal) se realizó el mismo procedimiento. (ilustración 2)

- Al finalizar las aplicaciones de las alícuotas, en el extremo superior de la tira se realizaron 2 perforaciones colocando hilos en ambas, de modo que al fijar la tira con cinta adhesiva dentro del frasco ésta quedara de forma vertical y de este modo fuera humedecida por la mezcla de butanol-ácido acético—agua.[pic 25][pic 26][pic 27]

- Finalmente se preparó una solución de ninhidrina con 0.2g en 100mL de acetona, con la cual se roció la tira (con el fin de revelar la posición de las sustancias)después de dejar correr 2 horas la cromatografía y secar,

Resultados

En el corrimiento cromatográfico (ilustración 4) se observan 4 bandas teñidas de color, correspondientes a las 4 muestras utilizadas, en las cuales es posible identificar diferentes tamaños y distancias.

[pic 28]

[pic 29]

Muestras

Distancia recorrida por la mezcla eluyente

Distancia recorridas por las muestras

Rf de las muestras

Fenilalanina

8.5 cm

4.8 cm

0.5647

Acido aspártico

3.7 cm

0.4352

Refresco dietético

No se alcanza a distinguir

Refresco no dietético

1.8 cm

0.2117

Ninguna muestra estudiada presentó el mismo Rf, ya que la tendencia relativa de las moléculas en la mezcla (aminoácidos) para asociarse con mayor fuerza a una o a otra fase no es la misma. A pesar de no distinguirse con claridad los corrimientos, se puede notar que los dos tipos de refresco no presentan el mismo patrón de disociación, asimismo el valor de Rf debe de ser distinto y por ende queda determinado que el aspartame está presente en el refresco dietético y no en el refresco normal.

Actividades finales

1. Usando la ecuación de Henderson –Hasselbalch, calcular el pH de cada grupo ionizable.

Fenilalanina

Pka1= 1.83 pka2= 9.29

pH= log = log = 1.96[pic 30][pic 31]

pH= log = log = 2.66[pic 32][pic 33]

Acido aspártico

Pka1= 2.09 pka2= 9.82

pH= log = log = 2.01[pic 34][pic 35]

pH= log = log = 2.69[pic 36][pic 37]

La fórmula utilizada relaciona la concentración disociada del aminoácido directamente con su pka, en base a esta correlación se puede calcular el pH, en esta ocasión se calculó el pH que tenían los aminoácidos relacionados con la práctica de cromatografía realizada.

Conclusiones

Con la realización de esta práctica aprendimos que en la cromatografía sobre papel, las interacciones del soluto con el papel hacen que los compuestos se desplacen a velocidades diferentes.

Una pequeña mancha de disolución que contiene la muestra se aplicó sobre una tira de papel cromatográfico a una distancia aproximada de un centímetro de la base. En este caso las muestras fueron fenilalanina, acido aspártico, refresco dietético y refresco normal. Las muestras fueron adsorbidas por el papel. Esto significa que las muestras entraron en contacto con el papel y pueden establecer interacciones. El papel es sumergido en un disolvente adecuado (etanol o agua) e introducido en un contenedor cerrado. A medida que el disolvente ascendió por el papel, encontró la muestra, que empezó a viajar por el papel con el disolvente. Los diferentes compuestos de la muestra recorren distancias diferentes dependiendo de la fuerza de sus interacciones químicas con el papel. Nos dimos cuenta que la cromatografía en papel requiere de relativamente bastante tiempo, habitualmente se necesitan varias horas para completarse.

La cromatografía en papel es una técnica muy fácil de poner en práctica y debido a su bajo costo resulta ser muy accesible, requiere de bastante tiempo pero si se hace correctamente se pueden obtener resultados positivos.

Bibliografía

- Ayres, G.1970. Análisis Químico Cuantitativo, 2da edición,Harper & Row Latinoamericana, Mexico.

- Boyer, R. 2000. Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores, México.

- Voet, D. y Voet J. G. 2006. Bioquímica, 3ra edición, Medica Panamericana, México.