Mejora de la expresión de Factor IX humano recombinante por coexpresión de GGCX, VKOR y Furi

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Expresión FIX vectores F9NopA y F9hglx

el factor IX de coagulación humano cDNA (GenBank NM_000133) fue amplificado a partir de ADNc de genes humanos piscina hígado (Invitrogen) utilizando oligonucleótidos f9f. AMPL (50-CACCATGCAGCGCGTGAACATGAT-30) y F9r.ampl fragmento (50-CCTTGGAAATCCATCTTTCATTA-30) .El FIX humano fue amplificado por PCR utilizando ADN polimerasa Pfx. El producto de PCR de extremos romos se fosforiló usando polinucleótido quinasa de T4, y se clonó en el EcoRV digerido y fosforilado-de pcDNA-GGCX vectores NOPA y hglx, para dar F9NopA y F9hglx, respectivamente. secuencias del vector de expresión del final están disponibles en GenBank con los números de JA237977 para F9hglx y JA237976 para F9NopA.

higro vector VKOR

La secuencia de codificación de VKOR fue PCR amplificado a partir de ADNc de hígado humano (Clontech) usando los cebadores: VF1 (50-CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA-30) y VR1 (50GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-30) y TA-TOPO se clonó en pcDNA3.1-V5 / His (Invitrogen). La secuencia de codificación de VKOR fue liberado por HindIII y NotI y después subclonado en el vector pcDNA3.1Hygro usando las mismas enzimas de restricción para dar construir pVKORhygro (GenBank DM079693 adhesión).

Vector pZ eoSV2-furina

La furina humana / PACE secuencia codificante se clonó en pZeoSV2 (+) vector (Invitrogen), utilizando la A fl II y de restricción EcoRV sitios para obtener pZeoSV2-furina (GenBank KF886270). Las secuencias de codificación correctos de FIX, GGCX, VKOR y furina se confirmaron por secuenciación de ADN.

Desarrollo de líneas celulares FIX humano

células CHO-S se cultivaron en DMEM F12 con GlutaMAX y 10% de FBS, y se transfectaron con F9NopA linealizado o F9hglx de acuerdo a las recomendaciones de Invitrogen. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos con medio selectivo que contenía G418 el día después de la transfección. La detección de la expresión rhFIX hecho por ELISA. La mejor piscina FIX clon que produce se sometió a clonación por dilución límite. Durante la expansión clones se seleccionaron para la expresión en varias ocasiones rhFIX usando un ELISA. Se seleccionaron tres clones por constructo y adaptadas al crecimiento en medio libre de suero. Después de la adaptación, los clones se evaluaron y se compararon sobre la base de las propiedades de crecimiento y el nivel de expresión rhFIX (utilizando tanto ELISA y análisis de transferencia Western). El mejor clon N4D5 se encontró a partir de las células transfectadas F9NopA. a continuación, el clon N4D5 se transfectadas con el constructo VKORhygro, linealizado con SspI, e higromicina clones resistentes fueron seleccionados y se seleccionan para mejorar la productividad tanto con ensayo de actividad de FIX y ELISA. Después de limitar la clonación de dilución y ensayo de productividad se eligió el clon A2F8 para estudios adicionales. La línea celular se transfectó con A2F8 pZeoSV2-furina, linealizado por la enzima de restricción SspI. Después de la selección de zeocina, piscinas oligo-clonales estables fueron seleccionados para la mejora de la productividad arreglo mediante un ensayo cromogénico FIX (ROXFIX) y el clon 2F6 fue seleccionado y crio-conservados en un medio CD-CHO con un 5% de DMSO.

Cuantificación de prefijo y GGCX mRNA Expresión

clones hFIX productoras recombinantes se cultivaron a 32 a 37? C, en 100 ml de proteínas libre químicamente de fi medio definido suplementado con vitamina K. Las muestras de 5 a 10 ml se recogieron en el pico de concentración rhFIX y el ARN se aisló con TrizolTM de acuerdo con el protocolo suministrado por el proveedor (Invitrogen). El ARN aislado fue tratado con DNasa I. con el kit de ADN-FreeTM de Ambion. la síntesis de ADNc se realizó utilizando hexámeros cebadores y el contenido del kit de síntesis del sistema Superscript First-Strand para RT-PCR (Invitrogen). El ARN se analizó el contenido de FIX humano y GGCX transcripciones humanos, así como transcripciones de control GAPDH (mantenimiento de la casa) de genes, que se utilizó para permitir la comparación de diferentes muestras.

Los cebadores para rhFIX fueron:

• Reenviar imprimación; 50-AATAGTGCTGATAACAAGGT GGTTTG-30,

• cebador inverso; 50-CACTGCTGGTTCACAGGACTT CT-30 y

• La sonda; 50-TCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCA GAAAAC-30 (Longitud de amplicón 84 pb).

cebadores GGCX humanos fueron los siguientes:

• Reenviar imprimación; 50-ACACCTCTGGTTCAGACCTTT CTT-30,

• cebador inverso; 50-AATCGCTCATGGAAAGGAGTA TTT-30 y • La sonda; 50-CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAAC GC-30 (Longitud de amplicón 86 pb).

Los cebadores fueron fabricados por Operon / Qiagen y las sondas fueron ordenados de Applied Biosystems. También se utilizaron cebadores de control de roedores y GAPDH sonda (Applied Biosystems, ABI # 4308318 TaqMan roedor control GAPDH Protocolo Reactivos?) -Amplicon longitud de 177 pb. Las reacciones en tiempo real RT-PCR se realizaron en el detector de secuencias ABI PRISMTM 7700, Applied Biosystems. La duración prevista de los productos de PCR ampli fi cados se confirmó en geles de agarosa.

los niveles de ARN mensajero se encontraron a pico en diferentes días dependiendo de la temperatura de cultivo y el tamaño de cultivo de inóculo, pero se encontró que corresponden bien con la concentración máxima de rhFIX en el medio de cultivo.

Expresión y Purificación de rhFIX

Las células se inocularon en medio fresco de cultivo CD-CHO, suplementado con 19 HT, 19 Glutamax, 19 NEAA y 0,5 lg / ml de vitamina K. Las células se cultivaron a una densidad de 5,3 9 106 células / ml en el movimiento de matraces se incubaron a 37? C , 10% de CO2 y 150 rpm). El medio se cambia entonces a una de desarrollo propio medio de producción y la densidad de células ajustadas a 4 9 106 células / ml. HFIX recombinante se expresó durante 4 días a 32 ° C, 10% de CO2 antes de la cosecha. El medio de cultivo cosechado se concentró y se cambió de tampón a Buffer A0 (mM Hepes 25, 0,4% Na-citrato, NaCl 50 mM, pH 6,8). La muestra se cargó en una columna ml HiTrap Q FF 5 (GE Healthcare, Suecia) pre-equilibrada con Tampón A0 utilizando ¨ FPLC KTA (GE Healthcare, Suecia). Después de la carga, la columna se lavó con tampón de A0 primera, a continuación, se lavó con Tampón