Práctica 1. Biotransformación de acetoacetato de etilo con levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae).

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La fase superior se vierte por la boca del embudo a otro Erlenmeyer, evitando así que se impurifique con restos de la fase inferior que hayan quedado en la llave o en el vástago. Si la fase superior tiene que extraerse de nuevo, no es necesario sacarla del embudo.

- Secado de la fase orgánica: El conjunto de fases orgánicas recogidas en las diferentes extracciones se lava con disolución saturada de cloruro sódico, que retiene el agua de la fase orgánica con el fin de incrementar la solvatación de la sal. A continuación, se eliminan las trazas de agua utilizando un agente inerte, generalmente sulfato sódico o magnésico anhídridos. Se añade a la fase orgánica una cantidad de desecante proporcional a la cantidad de disolvente, suficiente para cubrir el fondo del Erlenmeyer. Se agita ligeramente alrededor de su posición vertical, se deja en reposo y se tapa para evitar la evaporación del disolvente. Se espera un tiempo (generalmente de 10 a 15 minutos), hasta que la turbidez inicial desaparezca y la disolución esté completamente transparente.

- Filtración y eliminación del disolvente: El agente desecante hidratado se filtra por gravedad sobre un matraz, utilizando un embudo cónico y un filtro de pliegues o una placa filtrante. El Erlenmeyer, el agente desecante y el filtro se lavan con el mismo disolvente para evitar pérdidas de producto. El disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor, aislándose se este modo el compuesto extraído, que posteriormente deberá purificarse.

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- ¿Qué es y cómo se realiza la cromatografía en capa fina?

La cromatografía en capa fina (en inglés thin layer chromatography o TLC) es una técnica analítica rápida y sencilla. Entre otras cosas permite:

-Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación.

-Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia.

-Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado.

En un vial poner con una pipeta una pequeña cantidad de una muestra disuelta en acetato de etilo (que cubra el fondo del vial y un poco más). En otros dos viales diferentes poner otra muestra en cada uno de la misma forma. Las tres disoluciones de las muestras en acetato de etilo estarán ya preparadas.

En una placa de TLC nueva se traza con lápiz una línea a 7‐10 mm del borde inferior y se señalan sobre ella tres puntos equidistantes y no demasiado cerca del borde.

Con ayuda de una micropipeta de vidrio se toma una muestra de un vial. Se introduce la micropipeta y el líquido sube por ella por capilaridad. Al tocar brevemente la placa con la micropipeta el líquido se absorbe en la placa también por capilaridad. Se pincha brevemente tres veces en el punto para conseguir una mancha de pequeño tamaño que da mejor resolución.

Después de poner una mancha se lava la micropipeta introduciendo la punta en acetona en un vial, se deja que se llene hasta la mitad y se pincha sobre papel de filtro para que absorba la acetona. Repetir el lavado tres veces. La pipeta se reutiliza para la siguiente muestra, repitiendo el proceso de poner la muestra en la placa y el lavado. La placa de TLC se deposita dentro de una cubeta de cromatografía, a la que previamente se ha añadido una pequeña cantidad del eluyente deseado. Hay que tener cuidado de que el nivel de eluyente esté por debajo del punto donde ha sido "pinchado" el producto. Se tapa la cubeta y se deja que el eluyente ascienda por capilaridad.

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- ¿Cuál es la función de la sacarosa, del fosfato de sodio dibásico heptahidratado y del agua en el medio de cultivo?

La nutrición que es desarrollada en las condiciones in vitro a partir en los diferentes órganos y tejidos son ampliamente heterótrofos con respecto al carbono debido a la ausencia o insuficiencia de asimilación clorofílica, por lo cual resulta indispensable añadir azúcares a los medios de cultivo como fuente de energía y reguladores osmóticos. La sacarosa es el azúcar empleado universalmente, es preciso tener en cuenta que un disacárido como la sacarosa se convierte (por hidrólisis) durante la esterilización, en dos monosacáridos (glucosa y fructuosa), lo que provoca un cambio en su potencial osmótico.

El fosfato de sodio dibásico heptahidratado funciona como amortiguador del pH en el medio de cultivo manteniendo el equilibrio osmótico.

- ¿Cuál es la reacción de biotransformación que lleva a cabo la levadura con el acetoacetato de etilo? Dibujar la estereoquímica del producto.

Bajo ciertas condiciones la levadura, aumenta la formación de ésteres carboxílicos de cadena larga. El perfil de ésteres y su concentración depende de la cepa de la levadura, el acetoacetato de etilo está relacionado con los sabores frutales. Diferentes temperaturas de fermentación, generan diferentes perfiles.

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- ¿Cuál es la solubilidad del cloruro de sodio en agua?

35.9 g por 100 ml de agua.

- ¿Cuáles son las propiedades físicas y químicas del producto que se obtiene en esta práctica?

Aspecto: LIQUIDO

Color: INCOLORO - AMARILLO PALIDO

Olor: AFRUTADO

Punto de Ebullición: °C Densidad: 1,015 g/cm³ (20 °C)

Punto de Inflamación: 77 °C

Índice de Refracción: 1,418 - 1,424 (20 °C)

- ¿Qué es cromatografía?

La cromatografía es esencialmente un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (fase estacionaria), y otra móvil (fase móvil) la cual percola a través de la primera. El proceso cromatográfico se da como resultado de repetidos procesos de sorción-desorción durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados por la fase móvil a lo largo de la fase estacionaria (elución),