Proteinas. Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos

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METODO:

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo

Pipetas de automáticas regulables de 20-100 µl y de 200-1000 µl 3

Espectofotómetro

Agua destilada

Soluciones estándar de proteína

Reactivo de BCA

PROCEDIMIENTO:

Añadir 1 ml del reactivo de trabajo de BCA a los tubos estándar y muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla V. Incubar 10 min a 60 ºC y leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco.[pic 7]

TIPO DE REACCION:[pic 8]

[pic 9]

FUNDAMENTO:

En el método de Lowry a la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= ε.l.c Este método consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.

2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador

METODO:

Materiales .-

Tubos de ensayo -.-

Tubos Falcon (50 mL) .-

Pipetas .-

Colorímetro .-

Cubetas de colorímetro

.- Agitadores de tubos

Reactivos - Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M

- Reactivo B1: CuSO4 ⋅ 5H2O al 1%

- Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 2%

- Reactivo C: Se prepara, mezclando los reactivos: A, B1 y B2, en proporciones 50:0,5:0,5 (en volumen)

- Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a ¼

- Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg/mL)

- Muestra problema

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Para determinar la concentración de proteínas de la muestra problema se construye una curva patrón o de calibrado a partir de una solución patrón (BSA) (2 mg/mL). La concentración que tienen las muestras problema se determina por interpolación de los valores de absorbancia en la curva patrón. El tubo 0, que sólo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del colorímetro a cero de absorbancia. Pasos a seguir: a) Numerar del 0 al 6, tubos de plástico de 10 mL b) Pipetear las cantidades de agua, solución patrón de albúmina y solución problema señaladas en la tabla. c) Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2 d) Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo y dejarlo reposar 15 minutos en oscuridad (dentro de la taquilla). e) A continuación añadir a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido 1/4), mezclando bien por agitación. Dejar reposar 30 minutos en la oscuridad para que así se desarrolle completamente la reacción coloreada. f) Leer las absorbancias en el colorímetro a 580 nm. Previamente el aparato se ajusta a Absorbancia=0 con el blanco (tubo nº 0); de esa forma sólo se mide el color producido por las proteínas, puesto que se resta el color debido a los reactivos.

[pic 10][pic 11]

TIPO DE REACCION:

Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas

VENTAJAS:

- Es sensible

- Menos afectado por la turbidez de la muestra

- Mas especifico que la mayoria de los otros métodos

- Relativamente simple

- Se puede completar de 1 a 15 horas

DESVENTAJA:

- El color varia con diferentes proteínas (mas que el método de biuret)

- El color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteínas

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BIBLIOGRAFÍA

O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)