Espectrofotometría y detección de carbohidratos

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Objetivos

Objetivos principales

- Cuantificar proteínas de leche comercial mediante espectrofotometría utilizando el método de Bradford.

- Conocer los métodos de identificación de carbohidratos.

Objetivos especificos

- Conocer e identificar los diferentes métodos de detección de carbohidratos que se usaron en el laboratorio.

- Entender en que se basa la ley de lambert-beer con respecto a la fotometría.

- Aprender el correcto funcionamiento del espectrofotómetro.

Materiales y Metodología

Materiales

Materiales y reactivos utilizados en ambos prácticos (tabla 1)

Materiales

Reactivos

- Espectrofotómetro Spectronic

- Cubetas de plástico

- Tubos Eppendorf

- Micropipetas de 10 L, 200 L y 1000 mL

- Reactivo de Bradford (RB)

- Leche comercial

- Solución de albúmina de suero de bovino (BSA)

- Agua destilada

- Ácido sulfúrico

- Alfa naftol

- Fenol al 5 %

- DNS

- NaOH

- Glucosa

Metodología

Espectrofotometría

Para realizar la curva de calibración se prepararon las siguientes diluciones mostradas en la siguiente tabla 1, a base de una solución stock de BSA ya preparada (2 mg/mL)

Tabla de concentración para la curva de calibración con BSA (tabla 2)

Volumen solución stock

Volumen agua destilada

Concentración final de BSA (mg/mL)

0

200

0

10

190

0,1

20

180

0,2

40

160

0,4

60

140

0,6

80

120

0,8

100

100

1,0

200

0

2,0

En los respectivos tubos Eppendorf ya rotulados con sus distintas concentraciones se agregó 200L de cada una de las diluciones y 1mL de reactivo de Bradford.

Estos tubos se incubaron a 37 °C (incubados por calor corporal) por 30 min en oscuridad, guardados en los bolsillos.

Luego se dejaron reposar por unos 5 minutos a temperatura ambiente para luego determinar la absorbancia a 600 nm.

Para realizar el cálculo y medición de la cantidad de proteínas que presentaba la leche comercial (leche con chocolate) se preparó una dilución 1:50 de la leche comercial en agua destilada obteniendo tres muestras y por último se realizó el mismo procedimiento usado para realizar la curva de calibración. Todo este proceso se realizó para poder obtener la cantidad de proteínas que contiene la leche comercial en g/L.

Detección de Carbohidratos

Prueba de Dubois: determinación de azúcares totales.

En primer lugar se solicitó generar una curva de calibración por lo que el experimento se hizo con las concentraciones de 0%; 0,05%; 0,2%; 0,5%; 1,0% y 2,0% de glucosa, de 200 ml cada muestra. En cada tubo de vidrio se agregaron 2 mL de las soluciones preparadas, luego se le agregaron 50 L de fenol al 80 %.

Luego se agregó cuidadosamente 5 mL del ácido sulfúrico bajo campana. El ácido se agregó directamente en la superficie del líquido ya presente en el tubo de ensayo y no sobre sus paredes. Después de esto los tubos de ensayo se dejaron reposar por unos 10 min, para luego agitarlos y colocarlos por unos 10-20 minutos a baño de agua a 25-30 °C antes de la realizar la lectura en el espectrofotómetro.

La absorción del color amarillo-naranjo característico se midió a 490 nm para hexosas y 480 nm para pentosas y ácidos urónicos. Estos datos obtenidos de cada muestra se utilizaran para generar la curva de calibración.

Finalmente se prepararon 3 muestras iguales con la relación 1:40 de la solución a analizar (jugo de pera) con agua destilada para determinar la cantidad de azúcares totales y se realizó el mismo procedimiento ya mencionado anteriormente.

Prueba de Miller: determinación de azúcares reductores.

Para la aplicación del método de Miller el reactivo DNS ya estaba preparado al comenzar el laboratorio. Para medir la concentración de azúcares reductores se utiliza una curva de calibración de absorbancia en función de la concentración. Para obtener esta curva se prepararon soluciones de 200-1000 mg/L utilizando soluciones de glucosa.

En cada tubo de ensayo rotulado con su concentración de glucosa se colocaron 0,5 mL de cada solución para luego agregar 0,5 mL de DNS, mientras se preparaba un envase de vidrio con agua hirviendo para el siguiente paso.

Luego los tubos de ensayos se colocaron dentro del envase de vidrio con agua en su punto de ebullición por 5 min que fueron cronometrados, cuando se acabo el