Estrés oxidativo.

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Preparación del extracto acuoso

Realizada la pulverización de las plantas desecadas, se pesaron 50 g de este material y se agregaron en un litro de agua hirviendo dejándolo reposar por 20 min a temperatura ambiente para permitir una buena extracción. Posteriormente, se filtró el extracto usando papel Whatman No1 (Hnatyszyn et al., 2002).

Para efectos de obtener la concentración final del extracto acuoso de la planta, se tomó 1 ml de la muestra y se evaporó completamente en una cocinilla y se pesó el residuo sólido. El extracto se congeló hasta el momento de su uso (Nwanjo et al., 2007).

Muestras biológicas

Tras el sacrificio de las ratas por sobredosis de éter dietílico, se disectaron los animales con un bisturí, para extraer los riñones, los cuales fueron usados para la determinación de las biomoléculas GSH, las MT y el contenido de proteínas totales (Beutler et al., 1963; Bradford, 1976; Viarengo et al., 1997; Hnatyszyn, et al. 2002; Mazunder, et al. 2005). Todas las muestras se tomaron para el tiempo indicado en el diseño experimental.

Extracción y cuantificación de metalotioneínas (MT)

Para evaluar el contenido de metalotioneínas, se empleó el método propuesto por Viarengo et al. (1997). Se disectó en frío 1 g del tejido renal y se homogenizó en frío con 3 ml de buffer tris-HCl 20 mmol.l-1 y 0,5 mol.kg-1 de sacarosa (pH 8,6), que contenía 0,006 mol.kg-1 de leupeptina, 0,5 mmol.l-1 PMSF (fenil-metil-sulfoxido) y β-mercaptoetanol (0,01%). El homogenizado se centrifugó a 3 000 g durante 20 minutos a 4°C, en una centrífuga refrigerada, y al sobrenadante resultante se le agregó 1,05 ml de etanol frío (-20°C) y 80 µl de cloroformo, luego fue centrifugado a 6 000 g por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante colectado se combinó con 1 mg de ARN y 40 µl de HCl al 37% y 3 volúmenes de etanol frío (87%) y fue mantenido a -20°C por una hora; luego se centrifugó a 6 000 g por 10 minutos y secado bajo una atmósfera de nitrógeno.

El pellet obtenido fue resuspendido en 150 µl de NaCl 0,25 mol.kg-1 y 150 µl de una mezcla de HCl 1 mol.kg-1 y 4 mmol.l-1 de ácido etilendiamino-tetracetato (EDTA). Seguidamente, se le agregaron 4,2 ml de NaCl 2 mol.kg-1 que contenía 0,43 mmol l-1 de 5,5'- dithiobis 2-ácido nitrobenzoico (DTNB) buferizado con Na-fosfato 0,2 mol.kg-1, pH 8. Finalmente, la muestra se centrifugó a 3 000 g por 5 minutos, se leyó la absorbancia del sobrenadante a 412 nm y la concentración de MT se estimó utilizando una curva de calibración para GSH. Estableciendo la siguiente relación equimolar (asumiendo que la tionina enlazadora de Cd, Zn de hígado de conejo tienen un contenido de cisteína de 18 Cys.mol-1 MT). 1 µl SH = l µl GSH = 0,055 µl MT (Ellman, 1959).

Determinación de la concentración de glutatión reducido (GSH)

La determinación de la concentración de GSH se llevó a cabo de acuerdo a la técnica de

Beutler, para la cual se prepararon 2 soluciones: una precipitante que estuvo formada por 1,67 g de ácido metafosfórico glacial (mezcla de PO32- y Na2PO3); 0,2 g de EDTA y 30 g de NaCl en 100 ml de agua destilada) y el reactivo DTNB al 0,4% en buffer fosfato, pH 7,5. Se mezclaron 0,2 ml de homogenizado de tejido renal con 1,8 ml de agua destilada; se adicionaron 3 ml de solución precipitante, se dejó en reposo por un tiempo de 5 minutos y se filtró. Posteriormente, a 2 ml del filtrado se le añadieron 8 ml de buffer fosfato y 1 ml del reactivo DTNB, y se midieron inmediatamente en el espectrofotómetro. Se preparó un blanco de reactivo con 8 ml de buffer fosfato, 2 ml de la solución precipitante diluida (2 a 3 partes de agua destilada) y 1 ml del reactivo DTNB. La densidad óptica fue medida a 412 nm en un espectrofotómetro. La estandarización del método se realizó con GSH, Sigma (Beutler et al., 1963).

Determinación de los niveles de proteínas totales

Para realizar este procedimiento, se aplicó la técnica de Bradford, la cual consistió en el siguiente procedimiento: 30 µl de homogenizado de tejido renal se mezclaron con 1 ml de reactivo de Bradford, se dejó reposar por 10 minutos e inmediatamente se midieron las concentraciones de proteínas totales en un espectrofotómetro a 595 nm (Bradford, 1976).

Análisis estadístico

Para la realización del análisis estadístico, de los resultados arrojados por ésta investigación, se empleó el método de Kruskal Wallis, con un nivel de confianza del 95% para demostrar las diferencias significativas entre las medianas de acuerdo a las condiciones experimentales, y una prueba a posteriori de rangos múltiples para determinar el comportamiento y diferencias entre las condiciones experimentales, mediante la comparación múltiple de medias. Los datos fueron expresados por medio de gráficos en cajas y bigotes, utilizando el programa estadístico Statgraphics Plus versión 5.0.