Hidroxilamina como agente mutagénico para NeurosporaCrassa

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- Tratamiento con ICR-170

ICR-170 es el código numérico asignado a Metoxi-6 cloro-9-(3--aminopropilamino) Clorhidrato de acridina.

Los conidios fueron suspendidos en un buffer de Fosfatos a 0.067 M pH de 7. El tratamiento se comenzó adicionando 1 volumen de Solución de ICR-170 (250mg/L H2O) recién preparada a 49 volúmenes de la suspensión de conidios, que da una concentración final de 10.5μM. El tratamiento fue terminado como se describió anteriormente 130 min después del comienzo del tratamiento. El tratamiento y otras manipulaciones incluyendo ICR-170 y conidios fueron realizadas bajo luz roja para eliminar los efectos fotodinámicos asociados con el anillo de acridina, las placas también fueron incubadas en la oscuridad por lo menos 24 h para dar tiempo a los conidios de crecer a pequeñas colonias.[pic 1]

- Tratamiento con HA

Antes del tratamiento con HA, los conidios fueron suspendidos en NaCL 3M y a continuación diluidos 5 veces en la reacción de HA, dando una concentración final de HA de 1M. 5min después el tratamiento fue terminado, los conidios fueron centrifugados y decantados, y al momento de terminar los conidios fueron resuspendidos en NaCl 3M. Este procedimiento de lavado se realizó 2 veces y después los conidios fueron suspendidos en la solución de sal del medio mínimo de FRIE´S ajustado a pH 8.

- Medio en placa

Para estimar la viabilidad del tratamiento y de los conidios sin tratar, fueron sembrados en un medio de Westergaard suplementado con Sorbosa, glucosa, fructosa, ácido casamínico, una solución de vitamina como en el completado de glicerol y Sulfato de Adenina.

Para estimar el número de reversiones los conidios fueron sembrados en el mismo substrato usado para conteo de sobrevivientes pero suplementado con 0.2mg/L de Sulfato deAdenina en lugar de 25 mg/L.Los conidios fueron colocados en placas a una densidad de 106/mL y 2x105 conidios/mL. Para el conteo de reversiones después de los tratamientos con NA, EMS o ICR-170 la densidad de los conidios fue de 2x108 en un volumen total de 500mL

Para el conteo de las reversiones después del tratamiento con HA la densidad de los conidios fue de 2x105/ml en un volumen total de 500ml.

- Prueba estadística

La prueba para significancia está hecha de acuerdo a BIRNBAUM. EL número de reversiones es considerado como tener una distribución de Poisson. La probabilidad es calculada asumiendo que las sig 2 relaciones pertenecen a la misma población.

[pic 2]

[pic 3]

Una probabilidad menos a 5% indica una diferencia significativa entre el número de reversiones en el control y las series tratadas.

Resultados y Discusión

(a) Supresores

La identificación de la alteración genética por mutante determinando la especificidad en la inducción de reversiones después del tratamiento con agentes diferentes se puede distorsionar por la aparición de mutaciones por supresión junto con mutaciones por reversión. Los que se revirtieron de 20 mutantes diferentes inducidos en el Loci ad-3, han sido analizados por la ocurrencia de supresores extragenéticos, y ninguno fue encontrado, por lo tanto nosotros podríamos asumir que las ocurrencias de supresores fuera de los locus ad-3A o ad-3B son raros o que no ocurren.

La influencia de los supresores en la identificación de las alteraciones genéticas en mutantes ad-3 será discutido a continuación en otro documento. Además se está haciendo un análisis detallado de reversiones inducidas de mutantes ad-3P para proveer más información en este punto. Sin embargo, desde las reversiones de los mutantes en el presente set de prueba aparecieron antes y están en la parte principal sin acumular pigmentos purpuras usualmente producidos por mutantes ad-3, probablemente parece que la frecuencia de supresores extra génicos en el análisis presente es baja.

(b) Alteraciones genéticas inducidas por HA

La mutagenicidad de HA ha sido estudiada para determinar si hay especificidad en su actividad de acción por inducir reversiones con un set de prueba de 8 mutantes (Tabla 1). Basándose en los datos presentes, 4 de estas cepas parecen ser revertidas solo por sustitución de un par de bases (reversible por NA y EMS), 2 cepas parecen ser revertidas por la inserción o deleción de un par de bases (solo reversible por ICR-170), y 2 cepas se revirtieron solo espontáneamente.

ICR-170 es un gas de mostaza de acridina monofuncional; mutaciones adelantadas inducidas por ICR-170 en Neurosporacrassa principalmente parecen ser inserciones o deleciones de un par de bases. Por lo tanto es posible asumir que los mutantes que se revierten después del tratamiento con ICR-170 y no después del tratamiento con NA y EMS, que predominantemente inducen sustitución en un par de bases, se revierten por una inserción o deleción de un par de bases. Sin embargo se encontró que los mutantes que se revirtieron por una sustitución en un par de bases también se revirtieron después del tratamiento con ICR-170.

Esto puede explicarse por el hecho de que ICR-170 es un gas de mostaza monofuncional y además capaz de alquilar, el resultado de una alquilación en el DNA es usualmente una sustitución de un par de bases.

Las frecuencias de reversión después del tratamiento con HA son bajas comparadas con las frecuencias de reversión después del tratamiento con NA y EMS en frecuencia comparables de sobrevivencia. La cepa 2-A-ISS ha sido tratada con HA a pH 6.2 por varios periodos de tiempo. Una expresión directa para mostrar que HA tiene un efecto mutagénico en Neurospora puede obtenerse calculando la relación (M/Mo) donde M= número de las reversiones x106 conidios después del tratamiento con HA y Mo= Número de reversiones espontáneas x106 conidios. En la figura 1 se puede ver que nosotros obtuvimos 8 tiempos de muchos mutantes en las series tratadas con HA como en el control. Nosotros podemos además concluir que HA es mutagénico en Neurospora. La sobrevivencia no fue más baja que un 42% aun para los tratamientos más largos (fig 2). Se encontró que HA indce reversiones en 3 de las 4 cepas, las cuales se revirtieron por la sustitución de un par de bases (Tabla 1).

La falla de la sustitución de mutantes de cierto par de bases para revertir con HA puede ser explicada si asumimos que este