BIOTECNOLOGÍA DE ENZIMAS

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- Vectores de expresión

La cepa de producción requiere un vector de expresión optimizado, donde la mayor parte son plásmidos o fragmentos de ADN procedente de plásmidos que se unen al genoma del organismo hospedador en una copia. Los vectores de expresión suponen rendimientos altos, costos bajos tanto para el productor como para el consumidor.

- Cepas optimizadas para la producción de enzimas

Los transformantes óptimos son mejorados por mutagénesis, en donde se produce un cambio aleatorio en su genoma. Con esto se tienen mejores rendimientos y costos más bajos de las enzimas.

- Una alternativa a la tecnología del ADN

Tecnología del ADN recombinante en muchas ocasiones es difícil de aplicar para la obtención de cepas altamente productivas, ya que es necesario adicionar un agregado de enzimas con precisión. A más de esto la tecnología del ADN recombinante no es muy aceptado por la gran mayoría de los consumidores por la preocupación de los organismos genéticamente modificados. Por lo anteriormente dicho, se han buscado otras alternativas que faciliten la obtención de cepas mejoradas, uno de estos métodos es usando la forma tradicional de mejoramiento de cepas, la mutación y mejora. Esto empieza por la búsqueda primaria de cepas de alta calidad, en donde se analizan entre 10.000 y 100.000 mutaciones, seguido a esto se da una búsqueda secundaria, en donde se analizan las mutaciones de la búsqueda primaria para evidenciar su productividad enzimática. Como último paso, los mutantes obtenidos de la búsqueda secundaria son analizados a escala de fermentación, en el laboratorio, escogiéndose las mejores cepas para optimizaciones futuras.

- Ingeniería de proteínas y evolución dirigida

La ingeniería de proteínas puede ayudar a las enzimas naturales a superar algunos factores como las altas temperaturas, valores de pH extremos, y la agresividad de algunos productos químicos.

- Diseño racional de proteínas: ingeniería de proteínas

La ingeniería de proteínas selecciona un aminoácido específico y lo reemplaza en una proteína alterando así su termoestabilidad, pH óptimo, o especificidad de sustrato. Aquí se usa la mutagénesis dirigida para que los genes que codifican las proteínas sean alterados.

- Mutagénesis al azar y evolución dirigida

El proceso de evolución dirigida copia el proceso de evolución natural ya que usa la mutación genética, la selección y recombinación, confinándose a un gen específico. Este proceso empieza al mutagenizar aleatoriamente el gen codificador de la enzima diana, introduciendo errores a lo largo de la secuencia nucleótida, luego se clonan los genes mutagenizados en plásmidos y son introducidos en hospedadores unicelulares para su expresión, así cada célula recibirá una sola copia del gen mutado. Posteriormente, se analizan las células transformadas para comprobar su función y seleccionar las enzimas mejoradas.

- PRODUCCIÓN A GRAN ESCALA, RECUPERACIÓN Y FORMULACIÓN

- Esquema de fermentadores

- Fermentación discontinua (batch)

El inóculo crece sin realizar adición a la carga inicial de nutrientes.

- Fermentación alimentada

Se añaden nutrientes al fermentador, frecuentemente, durante la fase de crecimiento celular.

- Fermentación continua

Los nutrientes estériles se añaden al fermentador de forma continua, y sale del sistema el medio gastado, obteniéndose el equilibrio.

Se controla varios aspectos en el fermentador para maximizar los títulos de enzimas:

- La concentración de oxígeno disuelto

- El pH

- La temperatura

Posterior a la fermentación, se filtra para separar la enzima de la biomasa, otras operaciones pueden ser: floculación, centrifugación o combinadas. Seguidamente la enzima se concentra por membranas semipermeables o por proceso de evaporación. Finalmente, las enzimas son distribuidas en forma deseada para el consumidor. Las enzimas que son tratadas pueden tener variaciones en su estabilidad, actividad y comportamiento, para lo cual los productos enzimáticos deben cumplir lo siguiente:

- Actividad enzimática estable

- Forma física compatible con el uso deseado

- Producto seguro

- Formas líquidas

Son más fáciles de manejar. Esta formulación presenta algunos componentes típicos como agua y estabilizadores, como glicerol, sales y azúcar. Otras formas de productos líquidos de enzimas son las encapsulaciones, las cuales brindan mayor estabilidad y una liberación inmediata.

- Formas sólidas

Son generalmente un polvo fluido. Existe una gran variedad de presentaciones, así por ejemplo, en detergentes se usa un material ceroso para cubrir una partícula central con el cual se forma poco polvo; otro ejemplo es para el uso de enzimas inmovilizadas como la glucosa isomerasa. Las enzimas inmovilizadas sobre soportes sólidos son fácilmente reutilizadas y separadas de los productos de reacción. Las enzimas granuladas son generalmente preparadas por vaporización.