MANUAL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA - ALFA – AMILASA
Enviado por betoarellano • 24 de Agosto de 2019 • Apuntes • 304 Palabras (2 Páginas) • 502 Visitas
MANUAL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA - ALFA – AMILASA
Reactivos:
Solución de almidón al 0.1% en agua destilada
Buffer 1 cloruro de sodio pH5, 0,15M
Buffer 2 Acetato de sodio 0,1M
Sumar Buffer 1 + Buffer 2= Cloruro acetato (ajustar a pH5 con hidróxido 0,1N)
Solución reveladora
Pesar 0,006g de yodo + 0,06 g de Yoduro de potasio, disolver y aforar a 100ml con ácido clorhídrico
Ácido clorhídrico 0,02M
Disolver 1,65ml de ácido clorhídrico puro en 1L de agua
Preparación extracción enzimas:
- Pesamos 2 gramos de Enzimas previamente triturado
- Añadimos 20 ml de agua destilada
- Agitar por 10 minutos sin temperatura
- Filtrar con tela con un cilindro graduado y embudo
- Escurrir todo el líquido (mínimo 12 ml)
- Llenar 6 ependorff
- Centrifugar a 10000 rpm por 5 minutos
- Almacenar en el congelador
- Agregar 0,5ml de almidón 0,2% excepto al blanco
- Agregar 1ml de Buffer Cloruro acetato alfa amilasa al blanco
- Agregar 0,5ml de Buffer Cloruro acetato a los demás tubos de ensayo
- En un tubo de ensayo agrego 1 termómetro con 2ml de agua y lo ponemos en la gradilla
- Ponemos la gradilla en la incubadora
- Esperamos a que el termómetro del tubo de ensayo llegue a 37° C
- Agregar 10uL de extracto enzimático excepto el patrón y el blanco y agitar
- Esperar 8 minutos en baño maría
- Sacar la gradilla del baño maría
- Agregar 4,5ml de solución reveladora alfa amilasa yodo a todos los tubos de ensayo y agitar
- Leer a 580 nm.
Nota: Si los valores salen de la curva se tiene que agregar menos caldo enzimático y la diferencia la completamos con buffer, cambiamos la formula en Excel con el nuevo valor de caldo enzimático
Nota: La solución de almidón 0,2% no puede tener más de una semana
Nota: Previo a medir en el espectrofotómetro agitar los tubos de ensayo
...