MANUAL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA - ALFA – AMILASA

MANUAL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA -  ALFA – AMILASA

Reactivos:

Solución de almidón al 0.1% en agua destilada

Buffer 1 cloruro de sodio pH5, 0,15M

Buffer 2 Acetato de sodio 0,1M

Sumar Buffer 1 + Buffer 2= Cloruro acetato (ajustar a pH5 con hidróxido 0,1N)

Solución reveladora

Pesar 0,006g de yodo + 0,06 g de Yoduro de potasio, disolver y aforar a 100ml con ácido clorhídrico

Ácido clorhídrico 0,02M

Disolver 1,65ml de ácido clorhídrico puro en 1L de agua

Preparación extracción enzimas:

1. Pesamos 2 gramos de Enzimas previamente triturado
2. Añadimos 20 ml de agua destilada
3. Agitar por 10 minutos sin temperatura
4. Filtrar con tela con un cilindro graduado y embudo
5. Escurrir todo el líquido (mínimo 12 ml)
6. Llenar 6 ependorff
7. Centrifugar a 10000 rpm por 5 minutos
8. Almacenar en el congelador

1. Agregar 0,5ml de almidón 0,2%  excepto al blanco
2. Agregar 1ml de Buffer Cloruro acetato alfa amilasa al blanco
3. Agregar 0,5ml de Buffer Cloruro acetato a los demás tubos de ensayo
4. En un tubo de ensayo agrego 1 termómetro con 2ml de agua y lo ponemos en la gradilla
5. Ponemos la gradilla en la incubadora
6. Esperamos a que el termómetro del tubo de ensayo llegue a 37° C
7. Agregar 10uL de extracto enzimático excepto el patrón y el blanco y agitar
8. Esperar 8 minutos en baño maría
9. Sacar la gradilla del baño maría
10.  Agregar 4,5ml de solución reveladora alfa amilasa yodo a todos los tubos de ensayo y agitar
11. Leer a 580 nm.

Nota: Si los valores salen de la curva se tiene que agregar menos caldo enzimático y la diferencia la completamos con buffer, cambiamos la formula en Excel con el nuevo valor de caldo enzimático

Nota: La solución de almidón 0,2% no puede tener más de una semana

Nota: Previo a medir en el espectrofotómetro agitar los tubos de ensayo