LA ACTIVACIÓN Y LA INHIBICIÓN DE LA POLIFENOL OXIDASA EN LA UVA

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El primero es el ácido ascórbico, que actúa principalmente mediante la reducción de la quinona nuevo a la original o-difenol. Una vez que todo el inhibidor ha reaccionado, el producto de quinona amarillo comienza a aparecer. Sin embargo, los estudiantes se den cuenta de que la velocidad enzimática disminuye a medida que más ácido ascórbico se añade (Figura 2). Una clara disminución en la actividad se muestra cuando el ácido ascórbico alcanza 650 µM, por encima del cual el valor de la enzima es completamente inhibida debido a la inactivación de auto producido por la reacción de la naciente o-quinona en el sitio activo. El efecto se muestra en la Figura 2 se utiliza en la industria alimentaria para evitar los pigmentos marrones desagradables en verduras, mientras que son tratados antes de ser cocido, envasado o enlatado. Otro ejemplo de un agente reductor es metabisulfito de sodio, 6 que forma un producto de adición incoloro estable con quinonas. En primera este agente parece reaccionar de una manera similar al ácido ascórbico, el período de retraso aumenta con la concentración de inhibidor en el rango de 0 a 250 µM (Figura 3). Sin embargo, la disminución de la actividad es mayor que con ácido ascórbico para una concentración de inhibidor dada. Esto sugiere que metabisulfito tiene un efecto directo sobre la enzima. De hecho, este agente reductor puede unirse al centro activo de la enzima, inhibiendo directamente. Más detalles de su mecanismo de inhibición cinética se han publicado recientemente.

A pesar de la potencia inhibidora de metabisulfito de sodio, su uso en la tecnología de los alimentos y, especialmente, en la industria del vino tiende a ser estrictamente controlada y se elimina en lo posible a causa de la creciente conciencia de su posible efecto perjudicial para la salud. Es por esta razón que los enólogos tienen que probar este nivel en cada lote de vino que hacen. Los estudiantes se dan cuenta, durante la clase de discusión final, que la dosis de disulfito utilizado depende de las uvas utilizadas para purificar la enzima.

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Figura 2 Efecto del ácido ascórbico sobre la actividad de la polifenol oxidasa. El período de retardo es el tiempo entre el inicio de la reacción enzimática y el tiempo que la quinona puede ser seguido por el espectrofotómetro. La etiqueta de cada línea representa la concentración de ascorbato utilizado

LA ACTIVACIÓN DE LA ENZIMA LATENTE

Uno de los aspectos más interesantes de la planta de polifenol oxidasa bioquímica es la presencia de actividad enzimática latente, que puede ser activado por una variedad de tratamientos. Los estudiantes ponen a prueba dos posibles agentes activadores fisiológicos que se producen in vivo, probablemente durante daño a los tejidos de la planta. Estos son el contacto de la enzima latente con enzimas proteolíticas (tales como la tripsina) y con los lípidos de las membranas subcelulares desorbidos rotos.

El efecto de activación de la tripsina y los detergentes se muestra en la Figura 4. La tripsina es el mejor agente de activación, seguido de la catiónicos y los tensioactivos aniónicos, CTAB y SDS, * respectivamente. El efecto de la tripsina se debe a un ataque proteolítico en la polifenol oxidasa latente desde tripsina hervida falla para activar la enzima, cuya activación completa se alcanzó en cinco minutos utilizando una concentración de tripsina de 1000 U / ml.

El efecto de detergente (Figura 4) claramente señalado a los cambios estructurales en la proteína, ya que sólo los dos agentes tensioactivos de desnaturalización (CTAB y SDS) activa la enzima, mientras que el tensioactivo no iónico, Brij 96, no afecta a la latencia. Estos cambios estructurales se pueden ver en la figura 4, ya que sólo en el caso de Brij 96 hace la estructura de la enzima latente permanecen sin modificar lo que permite tripsina para activarlo. Sin embargo, las modificaciones estructurales causados por los agentes tensioactivos de desnaturalización prevenir el ataque de la tripsina.

Un experimento complementario muestra el parámetro clave en la acción de los agentes tensioactivos. Se incuba la enzima latente de 10 min en presencia de concentraciones de SDS que van desde 1 mM a 10 RAM. La curva de activación obtenido es hiperbólica (datos no mostrados) y se alcanza la actividad máxima después de la concentración de SDS es superior a la concentración micelar crítica (CMC = 8,2 mM), que es la concentración mínima de agente tensioactivo que produce la auto-asociación de monómeros para dar micelas . Esto indica que los monómeros tienen poco efecto sobre la estructura de la proteína, mientras que las micelas mixtas entre SDS y la proteína modifican la estructura 3-D de la proteína. Un comportamiento de activación similar de tensioactivos se ha visto en amplio polifenol oxidasa bean.

ORGANIZACIÓN:

Necesidades y organización de los grupos de estudiantes son los mismos instrumentales que se han descrito anteriormente, y los experimentos se pueden realizar con el material y el equipo presente en la mayoría de los laboratorios para sus alumnos. Todos los experimentos descritos en el presente documento se dividen en tres sesiones de cuatro horas cada una. En el primer período los estudiantes hacen los tampones y reactivos, purificar la enzima y la almacenan a -20 ° C. La siguiente sesión comienza por realizar la etapa de partición de fase de manera que se obtiene la enzima latente fresco. Esto permite a los estudiantes para observar el efecto de activación máxima con tripsina y detergentes. El último día se dedica a estudiar la inhibición y para una discusión de clase de una hora de los resultados. Por otra parte, si se necesita un curso práctico extendida, los experimentos descritos anteriormente se pueden continuar con los experimentos de cinética descritos anteriormente para esta enzima.

CONCLUSIONES

Los experimentos descritos en este documento introducen a los estudiantes en los procesos de activación e inhibición que pueden ocurrir in vivo. Estos procedimientos son experimentos complementarios a la caracterización básica de la planta de polifenol oxidasas, que permite a los estudiantes a entender la compleja regulación de estas enzimas generalizadas.

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Figura 3 Efecto de metabisulfito en la actividad de la polifenol oxidasa.

(0) Actividad y (0) período de retraso

Figura 4 La activación de la polifenol oxidasa latente con tripsina